Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

요약

여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.

초록

태반은 자궁 내 포유류의 발달을 조절하고 유지하는 필수 기관입니다. 태반은 산모와 태아 사이의 영양분과 노폐물의 전달, 성장 인자와 호르몬의 생산 및 전달을 담당합니다. 생쥐의 태반 유전자 조작은 태아 발달에서 태반의 특정 역할을 이해하는 데 중요합니다. 태반 특이적 Cre 발현 형질전환 마우스는 다양한 효과를 가지며 태반 유전자 조작을 위한 다른 방법이 유용한 대안이 될 수 있습니다. 이 논문은 표적 유전자의 발현을 수정하는 데 사용할 수 있는 CRISPR 유전자 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 기술을 설명합니다. 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 임신한 댐은 배아 12.5일(E12.5)에 개복술을 받고 CRISPR 플라스미드는 유리 마이크로피펫을 통해 개별 태반으로 전달됩니다. 플라스미드는 각 주입 후 즉시 전기천공됩니다. 댐 복구 후 태반과 배아는 나중에 평가될 때까지 계속 발달할 수 있습니다. 이 기술을 사용한 후 태반과 자손을 평가하면 발달에서 시간별 태반 기능의 역할을 결정할 수 있습니다. 이러한 유형의 조작을 통해 태반 유전학 및 기능이 여러 질병 상황에서 태아의 성장과 발달에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다.

서문

태반은 태아 발달에 관여하는 필수 기관입니다. 태반의 주요 역할은 필수 요소를 제공하고 태아와의 영양분과 노폐물의 이동을 조절하는 것입니다. 포유류의 태반은 태아와 모체의 조직으로 구성되어 있으며, 태아와 모체의 경계면을 이루고 있으며, 따라서 산모와 태아의 유전적 영향이 기능에 영향을 미친다¹. 태반의 유전적 기형이나 기능 장애는 태아 발달을 크게 변화시킬 수 있습니다. 이전 연구에서는 태반 유전학 및 발달이 태아의 특정 장기 시스템의 변화된 발달과 관련이 있음을 보여주었습니다. 특히, 태반의 이상은 태아의 뇌, 심장 및 혈관계의 변화와 관련이 있다 2,3,4,5.

호르몬, 성장 인자 및 기타 분자를 태반에서 태아로 운반하는 것은 태아 발달에 중요한 역할을 한다⁶. 특정 분자의 태반 생산을 변경하면 신경 발달이 바뀔 수 있음이 밝혀졌습니다. 산모의 염증은 태반에서 트립토판(TRP) 대사 유전자 발현을 변화시켜 세로토닌 생성을 증가시킬 수 있으며, 이는 이후 태아의 뇌에 세로토닌 축적을 생성한다⁷. 다른 연구에서는 심장 결함과 함께 태반 이상을 발견했습니다. 태반의 이상은 인간에게 가장 흔한 선천적 기형인 선천성 심장 기형의 원인이 되는 것으로 생각된다⁸. 최근 연구에 따르면 태반과 심장 모두에서 유사한 세포 경로를 가진 여러 유전자가 확인되었습니다. 이러한 경로가 중단되면 두 기관 모두에 결함이 발생할 수 있습니다⁹. 태반의 결함은 선천성 심장 결함을 악화시킬 수 있습니다. 특정 태아 장기 시스템 발달에 대한 태반 유전학 및 기능의 역할은 새로운 연구 분야입니다.

생쥐는 혈맥막 태반과 인간 태반의 다른 특징을 가지고 있어 인간 질병 연구에 매우 유용한 모델이 된다¹. 태반의 중요성에도 불구하고, 현재 표적 생체 내 유전자 조작이 부족합니다. 또한, 현재 태반의 과발현 또는 기능 획득 조작보다 녹아웃 또는 녹다운에 사용할 수 있는 옵션이 더 많다⁽¹⁰). 태반 특이적 조작을 위한 여러 형질전환 Cre 발현 라인이 있으며, 각각은 서로 다른 시점에서 서로 다른 영양막 계통에 있습니다. 여기에는 Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER 및 Gcm1-Cre^11,12,13,14가 포함됩니다. 이러한 Cre 이식유전자는 효율적이지만 특정 시점에서 일부 유전자를 조작할 수 없을 수 있습니다. 태반 유전자 발현을 녹아웃하거나 과발현하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 렌티바이러스 벡터를 배반포 배양에 삽입하는 것인데, 이는 영양모세포 특이적 유전자 조작을 유발합니다^15,16. 이 기술은 발달 초기에 태반 유전자 발현의 강력한 변화를 허용합니다. 생체 내에서 RNA 간섭의 사용은 태반에서 드물게 활용되었습니다. shRNA 플라스미드의 삽입은 본 논문에 기술된 CRIPSR 기법과 유사하게 수행될 수 있다. 이것은 태반에서 PlGF 발현을 성공적으로 감소시키기 위해 E13.5에서 수행되었으며, 자손의 뇌 혈관 구조에 영향을 미쳤다¹⁷.

녹아웃 또는 녹다운에 주로 사용되는 기술 외에도 과발현 유도는 일반적으로 아데노바이러스 또는 외인성 단백질의 삽입으로 수행됩니다. 과발현에 사용되는 기술은 다양한 성공률을 가지며 대부분 임신 후반에 수행되었습니다. 태반 기능에서 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)의 역할을 조사하기 위해 IGF-1 유전자^18,19의 과발현을 유도하기 위해 선소 매개 태반 유전자 전달을 수행했습니다. 이것은 직접 태반 주사를 통해 E18.5에서 마우스 임신 후기에 수행되었습니다. 추가 옵션을 제공하고 Cre-Lox 조합 실패, 아데노바이러스의 가능한 독성 및 shRNA의 비표적 효과와 같은 확립된 태반 유전자 조작의 가능한 실패를 피하기 위해 태반의 생체 내 직접 CRISPR 조작을 사용할 수 있습니다^20,21,22. 이 모델은 과발현 모델의 부족을 해결하고 유연성이 있는 모델을 만들기 위해 개발되었습니다.

이 기술은 PlGF 발현을 변경하기 위해 shRNA와 CRISPR 플라스미드를 생체 내에서 마우스 태반에 직접 표적으로 삼은 Lecuyer et al.의 연구를 기반으로 합니다¹⁷. 이 기술은 여러 시점에서 CRISPR 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 작업을 위해 E12.5가 선택되었습니다. 태반은 이 시점까지 성숙했고 조작할 수 있을 만큼 충분히 커서 E12.5에 특정 CRISPR 플라스미드를 삽입할 수 있으며, 이는 임신 중기에서 후기까지 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다^23,24. 형질전환 접근법과 달리 바이러스 유도 또는 RNA 간섭과 유사한 이 기술은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 특정 시점에서 과발현 또는 녹아웃을 허용하므로 이전 변화로 인한 태반 손상 또는 배아 치사 가능성을 방지합니다. 소수의 태반만이 한 배설물 내에서 실험 또는 대조 플라스미드를 받기 때문에 이 접근 방식은 두 가지 유형의 내부 제어를 허용합니다. 이러한 대조군은 적절한 대조군 플라스미드로 주입 및 전기천공된 대조군과 직접적인 조작을 받지 않는 대조군입니다. 이 기술은 상승 활성화 매개체(SAM) CRISPR 플라스미드를 통해 마우스 태반에서 IGF-1 유전자의 과발현을 생성하도록 최적화되었습니다. IGF-1 유전자는 출생 전에 태반에서 주로 생산되는 태아에게 전달되는 필수 성장 호르몬이기 때문에^{선택되었습니다 25,26}. 이 새로운 태반 표적 CRISPR 기술은 태반 기능과 태아 발달 사이의 연관성을 정의하는 데 도움이 되는 직접 조작을 가능하게 합니다.

프로토콜

모든 절차는 연방 규정 및 아이오와 대학 정책에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물과 축산

1. 동물에게 음식과 물을 임의로 12시간 일광 주기로 유지하십시오.
2. 생후 8-15주령의 CD-1 암컷 마우스를 사용한다. E0.5를 식별하기 위해 교합 플러그가 있는지 확인하십시오.
3. E0.5에서 임신한 댐을 단독으로 수용합니다.

2. 마이크로피펫의 교정

알림: 마이크로피펫의 보정은 가능하면 수술 전에 수행해야 합니다.

1. 마이크로피펫을 만들고 보정하기 전에 모든 플라스미드를 DNase가 없는 물에서 권장 농도(0.1μg/μL)로 희석합니다. 플라스미드를 적절하게 희석된 Fast Green 염료(PBS에서 1μg/μL)(최종 플라스미드 농도: 0.06μg/μL)와 혼합합니다.
2. 마이크로피펫 풀러로 외경 1.5mm, 내경 0.86mm의 10cm 유리 모세관을 사용하여 마이크로피펫을 당깁니다.
3. 멸균 집게로 마이크로 피펫 (2-3 mm)의 끝을 조심스럽게 떼어냅니다.
4. 마이크로인젝터에 부착된 마이크로모세관 팁에 마이크로피펫을 로드합니다. 마이크로 인젝터가 마이크로 주입기에 부착되어 있고 마이크로 피펫을 교정하기에 충분한 수준의 질소가 있는지 확인하십시오.
5. 마이크로피펫이 마이크로인젝터에 부착되면 Fast Green 염료 용액을 로드하여 보정을 수행합니다(PBS에서 1μg/μL). 마이크로피펫을 보정하여 약 3.5μL의 부피를 주입합니다. 아래와 같이 플라스미드 용액을 로딩하기 위해 마이크로피펫을 비우십시오("투명").
   참고: 각 마이크로피펫은 약간 다릅니다. 주사 중 태반 손상을 방지하려면 주사 시간을 0.5-1.5초 사이로 설정해야 합니다. 압력은 1-8.5psi 사이로 설정해야 합니다. 각 마이크로피펫을 개별적으로 보정합니다. 마이크로피펫을 이러한 매개변수 내에서 보정할 수 없는 경우 사용해서는 안 됩니다.

3. 수술(그림 1A)

알림: 준비하려면 준비 부위와 수술 부위의 표면을 70% 에탄올로 청소하십시오. 준비 영역에 흡수성 언더패드를 놓습니다. 수술 부위에 히팅 패드를 내려 놓고 그 위에 흡수성 언더 패드를 놓습니다. 수술 전에 모든 도구를 소독하십시오. 댐이 마취 상태에있는 시간은 1 시간 미만이어야합니다.

1. 마취
   1. 수술 30분에서 1시간 전에 임신한 댐에 5mg/kg의 NSAID(멜록시캄) 또는 다른 승인된 진통제를 투여하십시오.
   2. 임신한 댐을 이소플루란 기화기에 부착된 유도 챔버에 넣습니다.
   3. 기화기를 4% 이소플루란 및 3.5L/min 산소로 설정합니다.
   4. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 호흡률 감소로 마취가 확인되면 유도 챔버에서 준비 구역으로 댐을 제거합니다.
2. 수술 준비
   1. 준비 구역에서 코 콘으로 댐을 앙와위에 놓습니다.
   2. 댐이 노즈 콘에 있는 동안 기화기를 2% 이소플루란 및 3.5L/min 산소로 줄입니다.
   3. 댐의 복부를 철저히 면도하고 과도한 모피를 제거하십시오. 면도한 복부를 포비돈 용액과 70% 에탄올로 번갈아 가며 멸균 면봉 어플리케이터를 사용하여 세 번 코팅합니다. 포비돈 용액의 최종 코팅을 적용합니다. 각막 건조를 방지하려면 댐의 양쪽 눈에 인공 눈물 젤을 바르십시오(그림 2A, B).
   4. 준비가 끝나면 노즈 콘이 있는 댐을 지정된 수술 부위로 옮깁니다.
3. 자궁 개복술
   알림: 수술 과정 내내 멸균 장갑을 사용하십시오. 멸균되지 않은 표면이 접촉한 경우 장갑을 교체하십시오.
   1. 수술 부위에 댐을 누운 자세로 놓고 노즈콘을 테이프로 제자리에 고정합니다. 흡수 패드 아래의 가열 패드를 45 °C로 설정합니다.
   2. 집게와 가위를 사용하여 피부를 통해 약 2cm의 정중선 절개를합니다. 집게를 사용하여 피부를 천막으로 만들고 피부에 수직 절개를하십시오. 그런 다음 복막을 통해 비슷한 크기의 절개를 다시 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 수직 절개를 하는 동안 복막에 텐트를 칩니다(그림 2C, D).
      참고: 복막을 절개하는 동안 제대로 텐트를 치지 않으면 장의 치명적인 절개로 이어질 수 있습니다.
   3. 복부의 측면을 눌러 절개를 통해 자궁 뿔을 부드럽게 마사지하십시오. 우발적 인 부상을 방지하기 위해 손가락 만 사용하여 도구없이 자궁을 조심스럽게 안내하면됩니다. 노출된 자궁을 댐의 복부를 덮고 있는 멸균 수술용 드레이프 위에 놓고 필요에 따라 사용하기 전에 30°C로 데울 수 있는 멸균 식염수 방울로 수술 내내 촉촉하게 유지하십시오(그림 2E, F).
      참고: 자궁 뿔은 Wang et ^al.27에 설명된 대로 식별할 수 있습니다.
   4. 자궁이 노출되면 조작을 위해 세 쌍의 태반을 선택하십시오.
      참고: 태반은 Elmore et ^al.24에 설명된 대로 식별할 수 있습니다. 배아의 생존을 극대화하려면 6 개 이상의 태반을 치료해야합니다. 배아가 12개 미만인 경우 4개 이하의 태반을 주입해야 합니다. 하나는 대조 주사를 받고 다른 하나는 실험 플라스미드를 받도록 인접한 두 개의 태반을 선택합니다. 인접한 두 개의 태반을 사용하면 자궁의 유사한 위치에 있는 태반을 더 잘 비교할 수 있고 생존율도 높일 수 있습니다. 선택된 태반 쌍은 무작위로 선택되고 양쪽 자궁 뿔 전체에 걸쳐 이격됩니다(그림 1B).
   5. 태반 조작의 위치와 자궁 뿔 내 배아 조직을 기록하여 수집 중에 배아와 태반을 식별할 수 있도록 합니다., 하나의 댐이 대조 태반/배아를 모두 운반하기 때문입니다.
4. 대조군 플라스미드의 태반 주입 및 전기천공
   알림: 무균 기술을 유지하려면 사용하기 전에 전기 천공 패들과 미세 인젝터를 차가운 살균제로 멸균하십시오. 멸균되지 않은 표면이 접촉한 경우 장갑을 교체하십시오.
   1. 보정된 마이크로피펫을 사용하여 3회 주입을 위해 충분한 양의 적절한 대조군 플라스미드를 로드합니다. 탈락부(흰색)와 접합부(진한 빨간색) 사이의 태반에 측면으로 ~0.5mm 깊이에서 모든 주사를 수행합니다(그림 3A-F).
   2. 3개의 대조군 태반에 주사를 시행합니다.
      참고: 마이크로피펫과 플라스미드의 교차 오염을 방지하기 위해 실험 주입 전에 모든 대조군 플라스미드 주입을 수행하십시오. 이렇게 하면 마이크로피펫과 교정 시간을 변경하면 수술 시간이 크게 증가하고 댐 생존율이 감소하므로 동일한 마이크로피펫을 사용할 수 있습니다.
   3. 주입 후 2분 이내에 플라스미드 주입된 대조군 태반의 전기천공을 수행합니다.
   4. electroporation의 경우 electroporation 기계에 부착된 한 쌍의 3mm 패들을 사용하십시오. CRISPR 통합 효율과 배아의 생존 가능성을 보장하려면 2펄스, 30V, 30ms 펄스, 970ms 펄스 꺼짐, 단극 전기천공 설정을 사용하십시오.
   5. 주사 후 전기 천공 직전에 접촉 부위를 멸균 식염수로 코팅하고 식염수를 자궁벽의 세 부위에 정확하게 바르고 스포이드 또는 주사기로 패들을 도포합니다.
   6. 태반의 측면에 있는 전기 천공 패들을 부드럽게 누릅니다. 양극 패들을 주입 부위와 음극 바로 반대편에 놓습니다(그림 4A-C).
   7. electroporation 기계의 펄스를 누르고 electroporation 패들을 제거하기 전에 두 펄스가 완료될 때까지 기다립니다.
      알림: 맥박 동안 패들과 태반 사이에 소량의 흰색 거품이 자주 나타납니다. 이것이 발생하지 않으면 볼륨을 확인하십시오.tage 더 사용하기 전에 전압계로 패들에서. 전압계의 판독값이 electroporation vol과 일치하지 않는 경우tage 설정, 패들이 작동하지 않습니다.
5. 실험 플라스미드의 태반 주입 및 전기천공
   1. 3.4.1 단계와 동일한 지침을 따르십시오. 단계 3.4.2로 이동합니다. 대조군 플라스미드 대신 실험 플라스미드를 사용한다.
   2. 주입 후 2분 이내에 주입된 세 가지 실험 태반 모두의 전기천공을 수행합니다. 이는 대조군 플라스미드를 주입한 것과 동일한 방식으로 수행해야 합니다. 3.4.4단계를 따릅니다. 단계 3.4.7로 이동합니다.
6. 수술 완료
   1. 태반 조작이 완료되면 손가락만 사용하여 자궁 뿔을 복강 안으로 부드럽게 마사지합니다(그림 5A).
   2. 먼저 13mm 3/8c 바늘 합금으로 45cm 길이의 코팅 및 편조 용해성 봉합사를 사용하여 복막층에 이중 매듭 단일 봉합을 수행합니다. 봉합사를 2-3mm 간격으로 배치합니다(그림 5B).
   3. 복막 층을 봉합 한 후 용해성 봉합사로 피부를 봉합하십시오. 댐이 봉합을 취소할 수 없도록 단일 봉합사를 2-3mm 간격으로 삼중 매듭을 짓습니다(그림 5C).
   4. 봉합이 완료되면 이소플루란을 1%로, 산소를 3.5L/min으로 설정하고 조직의 접착제를 피부의 봉합사에 도포합니다(그림 5D).
      알림: 조직 접착제는 선택 사항이지만 댐 씹기로 인해 절개 부위가 다시 열리는 것을 방지하기 위해 권장됩니다.
   5. 조직 접착제가 마르면 기화기를 끄고 수술 부위에서 댐을 제거합니다. 댐을 뒤쪽에 있는 지지 케이지에 놓습니다.

4. 수술 후 관리 및 모니터링

1. 임신한 댐이 수술의 즉각적인 합병증이 없도록 최소 30분 동안 감독 하에 깨끗한 케이지에서 회복되도록 합니다. 완전히 걸을 수 있고 도움 없이 발로 뛸 수 있을 때까지 관찰하십시오. 수술 후 댐을 단독으로 수용하십시오.
2. 배아 수집까지 기관의 수술 후 관리 및 모니터링을 따르십시오. 댐 무게를 기록하고 봉합사와 절개 부위를 매일 모니터링합니다.

5. E14.5 태반 수집

1. E14.5에서 케타민/자일라진 칵테일(1mg/mL 케타민 및 0.1mg/mL 자일라진)로 댐을 심하게 마취한 다음 댐을 자궁경부로 탈구합니다.
2. 가위로 댐의 복부에 V 자 모양 절개를하고 자궁을 제거하십시오. 얼음 위의 5cm 페트리 접시에 즉시 놓습니다. 집게를 사용하여 자궁에서 배아와 해당 태반을 조심스럽게 제거하십시오.
   참고: 자궁 뿔의 배아 위치와 해당 태반을 기록하여 수술 중 직접 조작을 받은 태반을 확인합니다.
3. 태반 무게를 기록하십시오. RNAse가 없는 집게와 면도기를 사용하여 태반을 정중선 아래로 반으로 자릅니다. 4 °C에서 4 % PFA에 절반을 넣으십시오. 나머지 절반을 다시 반으로 자르고 나머지 2/4는 RNA 저장 시약이 있는 두 개의 튜브에 -80°C에서 보관합니다.
   참고: 배아 및 기타 모체 조직은 향후 사용을 위해 -80°C에서 컬렉션에서 보관할 수 있습니다.

6. 태반 유전자 발현 분석

1. RNA 저장 시약에 -80 ° C에서 보관 된 태반의 4 분의 1을 사용하십시오.
2. RNA 분리를 위한 Trizol 방법, RNA 농도를 위한 분광광도계, cDNA 합성 키트 및 SYBR Green Master Mix²⁸을 사용한 qPCR을 사용하여 Elser et al.에 설명된 대로 qPCR을 위한 태반을 처리합니다. Elser et al.에 언급된 Turbo DNAfree 키트 DNAse 대신에, Trizol RNA 분리 후 RNAcleanup 키트를 사용하여 샘플에 오염 물질이 포함되어 있지 않은지 확인한다²⁸.
   알림: Trizol에 대한 물질안전보건자료(MSDS)를 읽고 화학 흄 후드에 사용하십시오.
3. GFP 프라이머를 사용한 대조군 플라스미드 및 BLAST 프라이머를 사용한 실험 플라스미드의 플라스미드 삽입을 평가합니다( 보충 표 1에 나열된 프라이머). CT 값을 사용하여 플라스미드의 존재를 확인합니다.
   참고: 35 이상의 CT 값은 위양성이며 35 미만의 CT 값만 플라스미드가 성공적으로 삽입되었다는 양성 지표로 간주되어야 합니다.
4. 하우스키핑 유전자 18s로 정규화된 IGF-1 태반 발현을 평가합니다(보충 표 1에 나열된 프라이머). ddCT 방법을 사용하여 배수 변화를 계산한 다음 실험 샘플의 정규화된 배수 변화를 대조군 샘플의 평균 배수 변화로 계산합니다.

7. 태반 단백질 수준 분석

1. -80 °C에서 보관된 태반의 1/4을 사용하십시오. 최종 pH가 7.4인_diH2O중 11.5mM Tris HCl, 5mM_MgCl2 및 10mM 프로테아제 억제제로 만든 완충 용액에서 조직을 균질화합니다. 휴대용 균질화기와 유봉을 사용하여 조직을 분해하십시오.
   알림: sample은 버퍼 부피의 10%를 초과해서는 안 됩니다.
2. 균질화된 샘플을 1:12에서 완충액으로 희석하여 BCA(bicinchoninic acid assay) 키트의 검출 가능한 범위 내에 있도록 합니다. 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석을 수행하고 플레이트 리더를 사용하여 총 단백질을 정량화합니다.
3. BCA 분석을 수행 한 후 Gumusoglu et ^al.2에서와 같이 IGF-1 ELISA에 대해 모든 샘플을 동일한 총 단백질 농도 인 29 mg / mL로 표준화합니다.
4. 제조자의 지시에 따라 IGF-1 ELISA를 수행하고, 표준 농도 곡선을 사용하여 플레이트 판독기로 IGF-1 단백질 수준을 정량화한다.

8. 형광 in situ 하이브리드화 라벨링을 사용한 공간 CRIPSR 검증

1. 태반 반쪽을 4°C에서 4% PFA에 1-3일 동안 적절하게 고정한 후 4°C에서 20% 자당으로 옮긴 후 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 동결합니다.
2. OCT 내장 태반 반쪽을 -20°C 저온 유지 장치에서 10μm 섹션으로 연속적으로 분할하고 라벨을 붙일 슬라이드에 놓습니다. 세 개의 하위 영역이 모두 보이도록 태반을 반으로 나눕니다. in situ 하이브리드화에 사용될 때까지 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.
3. 제조업체의 프로토콜에 따라 FISH(Fluorescence in situ hybridization) 라벨링을 수행합니다. 하나의 슬라이드를 dCas9-3xNLS-VP64 프로브와 하이브리드화하고 동일한 태반의 두 번째 "자매" 슬라이드를 Prl8a8 프로브와 하이브리드화합니다.
   참고: dCas9-3xNLS-VP64 프로브는 과발현 플라스미드의 존재를 감지합니다. Prl8a8 프로브는 태반의 하위 영역을 식별할 수 있도록 하는 접합 영역의 해면영양모세포를 강조 표시합니다. 이 두 프로브는 태반의 녹색 자가형광과 다채널 형광의 간섭을 피하기 위해 별도의 "자매" 슬라이드에 레이블이 붙어 있습니다.
4. 두 프로브에 검출 염료(Opal 620)를 붙입니다. FISH에 대한 제조업체의 프로토콜을 완료한 후 DAPI 마운팅 매체를 적용하고 슬라이드에 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립을 투명 매니큐어로 밀봉합니다.
5. 정립 복합 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화하고 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 처리합니다. 여기서는 CellSens 소프트웨어가 사용되었습니다.

결과

일반 절차 결과(그림 6)
이 연구에는 세 가지 조작 된 그룹이있었습니다. 여기에는 일반적인 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드(Cas9 Control), 활성화 대조군 CRISPR 플라스미드(Act Control) 또는 IGF-1 SAM 활성화 플라스미드(Igf1-OE)가 주입된 태반이 포함되었습니다. Cas9 Control은 knockout 플라스미드에 더 적합하며, activation control은 과발현/활성화 플라스미드?...

토론

태반은 태아 성장의 일차적 조절인자이며, 앞서 언급했듯이 태반 유전자 발현 또는 기능의 변화는 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있다⁶. 여기에 설명된 프로토콜은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 마우스 태반의 표적 생체 내 CRISPR 조작을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 추가 연구에 사용할 수 있는 생존 가능한 배아와 해당 태반의 상당한 수확?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899.AP
96 Well plate	Cornings	3598	For BCA kit
Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Activation Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0277L	Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor	Vetamac	VAD-601TT	VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Protein quantification
Biovortexer	Bellco Glass, Inc.	198050000	Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software	Olympus	V4.1.1	Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810	Eppendorf	EP022628168	Plate centrifuge
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA isolation
Cotton Tipped Applicators	ProAdvantage	77100	Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	Dnase-free water provided for dilution
CryoStat	Leica	CM1950
Dissection Microscope	Leica	M125 C	Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures	Med Vet International	J385H
Distilled Water	Gibco	15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Thermo fisher Scientific	14190144	(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0662	Generator only
Electric Razor	Wahl	CL9990	Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0487	3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK	Grainger	21RK94	Placenta embedding cassettes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air Canisters	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF	Sigma	F7252-5G	Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)	Fisher Scientific	14377576	Can be used for BCA and ELISA
Forceps	VWR	82027-386	Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)	Sutter Instrument	B150-86-10	O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)	Thermo Scientific	1861281	Protein homogenization buffer
Heating Pad	Thermotech	S766D	Digitial Moist Heating Pad
Hemostats	VWR	10806-188	Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber	Vetamac	941443	No specific liter size required
Isoflurane	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal	Fisher Scientific	A451-4	RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Fisher Scientific	4309849	Barcoded plates not required
Microcapillary Tip	Eppendorf	5196082001	Attached to BTX Microinjector
Microinjector	BTX Harvard Apparatus	45-0766	Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)	BTX Harvard Apparatus	45-0751	MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)	scilogex	822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit	R & D Systems	MG100
Needles	BD - Becton, Dickson, and Company	305106	30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank	Linde	7727-37-9	Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone	Vetamac	921609	9-14 mm
Opal 620 detection dye	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound	Sakura	4583
Oxygen Tank	Linde	7782 - 44 - 7	Medical grade oxygen
Pestles	USA Scientific Inc	14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4367659	Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)	New England Biolabs	S1330S	Use for cDNA synthesis
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64	Advanced Cells Diagnostics	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	Dry oven for in situ hybridization
Scissors	VWR	82027-578	Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline)	Hospra	NDC 0409-4888-03	Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]	Research Product International	03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	Protein homogenization buffer
Steamer	Bella	B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape	Busse	696	Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60	Leica	3800160
Syringes	BD - Becton, Dickson, and Company	309659	BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer	Fisher Scientific	13-400-525	This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation
TSA Buffer Pack	Advanced Cells Diagnostics	322810	Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit	Vetamac	40200	Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope	Olympus	BX61VS	Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	Thermo Fisher Scientific	4453536	This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color	Amazon	C450B
Xylazine 20mg/ml	Anased	343730_RX