기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

요약

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

3D 세포 배양의 성장, 처리 및 모니터링을 위해 독립형 clinostat 인큐베이터를 사용할 때의 특성과 이점을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 클리노스타트는 세포가 낮은 전단력과 활발한 영양소 확산으로 재현성이 높은 스페로이드로 조립할 수 있는 환경을 모방합니다. 암 및 비암 간세포(HepG2/C3A 및 THLE-3 세포주) 모두 간세포에 필적하는 기능을 달성하기 전에 3주간의 성장이 필요하다는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜은 치료 시 스페로이드를 계산하고 측정하기 위해 스냅샷을 찍을 수 있기 때문에 세포 성장을 모니터링하는 카메라와 함께 3D 세포용 인큐베이터를 활용하는 편리함을 강조합니다. THLE-3 및 HepG2/C3A 세포주의 비교를 설명하여 비암성 세포주와 불멸화된 암세포가 어떻게 성장할 수 있는지 보여줍니다. 우리는 세포 신호 전달을 교란하지 않고, 즉 트립신화가 필요하지 않은 몇 가지 스페로이드에서 단백질체학 실험을 수행할 수 있는 방법을 시연하고 설명합니다. 우리는 단백질체학 분석을 사용하여 호흡 사슬 대사의 전형적인 간 표현형과 금속 해독에 관여하는 단백질 생성을 모니터링하고 스페로이드 면적을 계산하고 측정하는 반자동 시스템을 설명할 수 있음을 보여줍니다. 전체적으로 이 프로토콜은 이미지 캡처를 통한 표현형 특성 분석과 3D 세포 배양 모델을 실험하기 위한 단백질체학 파이프라인으로 구성된 도구 상자를 제공합니다.

서문

체외 세포 배양은 생물학의 기초 지식을 확립하는 데 필요하고 매우 귀중한 것으로 입증되었습니다. 특히 생물학과 암에 대한 과학적 이해의 대부분은 단층에서 자라는 세포인 2D 배양 시스템에서 비롯되었습니다. 2D 배양이 지배적인 세포 배양 시스템이었지만 잠재적으로 더 이상의 생물학적 진보를 저해할 수 있는 많은 단점이 있습니다. 예를 들어, 2D 배양은 세포 신호 전달 및 증식에 중요한 세포 간 상호 작용이 부족합니다¹. 현재까지 3D 배양 시스템은 분화, 약물 반응, 종양 침습 및 생물학 2,3,4,5를 더 잘 모델링하는 것으로 나타났습니다. 악성 암의 3D 모델링은 고령화 인구와 암 사망률의 증가로 인해 특히 중요합니다. 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 전 세계적으로 암 관련 사망률의 주요 원인 중 하나이며, 예후가 좋지 않은 경우가 많다⁶. 간세포암은 치료율이 낮고, 약물 반응이 좋지 않으며, 재발률이 높은 것으로 알려져^있다 6,7,8. 정상 간 및 간세포암에 대한 여러 3D 모델이 생체 내 정상 및 악성 간 조직 ^9,10의 생리학을 모방하여 개발되었습니다.

현재 3D 시스템에는 액체 오버레이, 바이오리액터, 하이드로겔, 스캐폴드 및 3D 프린팅 구조물이 포함됩니다. 생물반응기에서 생성된 스페로이드는 영양소 노출, 가스 교환 및 세포 증식/정지의 종양 분포를 모방하기 때문에 특히 고유한 이점을 제공합니다¹¹. 바이오리액터는 사용 편의성, 큰 확장성, 영양소 확산 및 접근성으로 인해 암 모델에 특히 적합하다¹¹. 또한 바이오리액터는 높은 처리량의 실험, 더 큰 재현성 및 인적 오류 감소를 허용할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 바이오리액터는 일반적인 바이오리액터에 적용되는 파괴적 전단력을 최소화하여 더 나은 재현성을 허용하는 감소된 중력 시스템을 시뮬레이션하기 때문에 독특합니다¹². 전방위 중력과 전단력의 감소는 세포가 보다 생리적인 방식으로 발달할 수 있도록 합니다. 증거로, 이 방법론에 따라 성장한 HepG2/C3A 세포는 생체 내 ATP, 아데닐레이트 키나아제, 요소 및 콜레스테롤^13,14을 생성하는 구형 소기관을 발달시킵니다. 또한 이 3D 시스템의 약물 치료는 2D 배양에 비해 더 발전되고 자동화되어 있습니다. 2D 배양에서 약물 치료는 트립신화하고 세포 건강을 유지해야 하기 때문에 짧은 시간 경과를 거쳐야 하는 경우가 많습니다. 그러나 우리의 경우 세포의 구조와 생리를 방해할 필요 없이 스페로이드의 장기 약물 치료를 수행할 수 있습니다. 따라서 생체 내 생물학적 현상을 더 잘 모델링하고 과학적 발전을 이루기 위해 2D에서 3D 배양으로의 전환이 필요합니다.

이 논문은 재현성이 높은 스페로이드를 성장시키는 방법론(그림 1 및 그림 2)을 제시하고 3D 구조를 표현형적으로 특성화하는 반자동 시스템(그림 3)을 보여줍니다. 이미지 수준에서는 스페로이드의 면적을 계산하고 측정하는 방법에 대한 정보를 제공합니다(그림 3). 질량 분석 방법을 사용하여 단백질체학을 사용하여 특정 생물학적 기능을 평가하는 방법을 보여줍니다(그림 4). 이 데이터를 수집하고 분석함으로써 3D 세포 배양 시스템 이면의 생물학에 대한 이해를 높일 수 있기를 바랍니다.

프로토콜

1. 완충액 및 시약

1. HepG2/C3A 세포용 세포 성장 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS), 비필수 아미노산(1% v/v), L-글루타민(1% v/v) 및 페니실린/스트렙토마이신(0.5% v/v)을 함유한 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지(DMEM, 4.5g/L 포도당)를 준비합니다. 성장 배지를 4°C에서 보관합니다.
2. THLE-3 세포용 세포 성장 배지: 보충제(소 뇌하수체 추출물[BPE], 하이드로코르티손, 인간 표피 성장 인자[hEGF], 에피네프린, 트랜스페린, 인슐린, 레티노산, 트리요오드티로닌, 겐타마이신 설페이트-암포테리신[GA])와 10% FBS, 5ng/mL hEGF 및 70ng/mL 포스포에탄올아민을 함유한 기관지 상피 세포 성장 배지[BEGM]를 준비합니다.
3. 500mM DL-디티오트레이톨(DTT): 10mL를 준비하려면 10mL의 HPLC 등급 물에 0.771g의 DTT를 재현탁시킵니다. -20°C에서 100μL 부분 표본을 보관합니다.
4. 200mM 요오드아세트아미드: 1mL를 제조하려면 50mM 중탄산암모늄 1mL에 요오드아세트아미드 36mg을 재현탁시킵니다. 재현탁 요오드아세트아미드를 보관하지 마십시오.
5. 5% 소듐 도데실 설페이트(SDS): 50mL를 제조하려면 50mM 중탄산 암모늄 50mL에 SDS 2.5g을 재현탁시킵니다. 4 °C에서 보관하십시오.
6. 12% 인산: 100mL를 준비하려면 85.9mL의 HPLC 등급 물에 85% 인산 14.1mL를 희석합니다. 유리병에 담아 실온(RT)에서 보관하십시오.
7. 결합 완충액: 1L를 제조하려면 농축 메탄올 900mL를 10mM 중탄산암모늄 또는 TEAB 100mL에 첨가합니다.
8. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 용액: 농축 TFA 1mL를 HPLC 등급 물 999mL에 첨가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
9. 60% 아세토니트릴/0.1% TFA 용액: 600mL의 HPLC 등급 아세토니트릴(60% v/v)을 399mL의 HPLC 등급 물에 추가합니다. 다음으로, 이 용액에 농축된 TFA 1mL를 첨가한 다음 4°C에서 보관합니다.
10. 이동상 A(MPA) - 0.1% 포름산: 농축 포름산 1mL를 HPLC 등급 물 999mL에 넣고 잘 섞습니다.
11. 이동상 B(MPB) - 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물 199mL에 HPLC 등급 아세토니트릴 800mL를 추가합니다. 다음으로, 이 용액에 농축 포름산 1mL를 넣고 섞는다.

2. 스페로이드의 제조

참고: 그림 1A 는 세포주에서 3D 스페로이드를 준비하고 배양하기 위한 초기 단계를 나타냅니다.

1. 냉동 HepG2/C3A 및 THLE-3 세포를 해동하고 조직 배양 플라스크 또는 접시에서 표준 성장 배지를 사용하여 약 80%의 밀도에 도달할 때까지 단층으로 성장시킵니다.
   알림: 세포가 밀도에 도달하면 현미경을 사용하여 일반적인 세포 형태와 성장 패턴을 확인합니다. 높은 구절 번호의 셀은 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, T75cm² 플라스크 또는 10cm 접시에 5mL 사용)으로 세포를 두 번 세척합니다.
3. HBSS에 희석한 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 추가하고(1:2 희석) 5%_CO2로 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포 분리를 평가하고 3mL의 FBS 또는 성장 배지(10% FBS 포함)를 추가하여 트립신 반응을 중화합니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 270 x g 으로 5분 동안 스핀 다운합니다.
5. 상층액을 흡인하고 5mL의 완전한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
   알림: 세포가 너무 많으면 계산하기 전에 세포 현탁액을 희석하십시오.
6. 세포 수를 계산하고 세포 현탁액을 완전 성장 배지에 희석하여 최대 부피 1.5mL의 1 x 10⁶ 을 얻습니다.
7. 마이크로웰을 포함하는 초저 부착 24웰 원형 바닥 플레이트를 평형화합니다.
   1. 0.5mL의 성장 배지로 웰을 세척합니다.
   2. 플레이트를 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다(이렇게 하면 웰 표면에서 기포가 제거됨).
8. 셀 현탁액(1.4단계에서 준비)을 플레이트와 원심분리기에 120 x g에서 3분 동안 옮깁니다.
   참고: 세포 현탁액 부피는 세포 수에 따라 달라질 수 있지만 1.5mL로 제한하는 것이 중요합니다.
9. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 24 시간 동안 플레이트를 배양하여 스페로이드 형성을 시작합니다.

3. 생물반응기로의 스페로이드 배양 (그림 2)

참고: 스페로이드의 구조를 보존하려면 3D 구를 다룰 때 넓은 보어 팁을 사용하십시오.

1. 스페로이드를 바이오리액터로 옮기기 전에 24시간 동안 습도 챔버에 25mL의 멸균수를 채우고 세포 챔버에 9mL의 성장 배지를 채워 바이오리액터의 평형을 맞춥니다(그림 2A). 습도 및 셀 챔버를 채울 때 긴 바늘에 연결된 10mL 주사기를 사용해야 합니다.
2. 3D 인큐베이터(그림 2D,F)에서 5%_CO2로 37°C에서 24시간 동안 회전(15rpm)하면서 바이오리액터를 배양합니다.2.
3. 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 초저 부착 플레이트에서 스페로이드를 분리하고 스페로이드를 조직 배양 접시로 옮깁니다.
4. 0.5mL의 미리 예열된 성장 배지로 초저 부착 플레이트를 세척하여 남은 스페로이드를 포집하고 3.3단계에서 동일한 접시로 옮깁니다.
5. 광학 현미경(4배 배율)을 사용하여 스페로이드의 크기, 조밀성 및 진원도를 평가하고 충분히 형성된 스페로이드를 선택합니다.
   알림: 셀은 컴팩트할 때 충분히 형성되고 취급 중에 분리되지 않습니다. 스페로이드가 단일 단위이고 함께 뭉치지 않는 것도 중요합니다. 100-200 μm 사이의 스페로이드 크기는 생물반응기로 이송될 때 바람직합니다.
6. 스페로이드를 5mL의 신선한 성장 배지로 채워진 평형 바이오리액터로 옮깁니다. 스페로이드를 옮긴 후 바이오리액터를 새로운 성장 배지로 완전히 채우고 배지를 채울 때 바이오리액터에 기포가 추가되지 않도록 하십시오.
7. 바이오리액터를 3D 인큐베이터에 넣고 제어 장치를 사용하여 회전 속도를 조정합니다(그림 2C). HepG2/C3A 스페로이드의 경우 회전 속도를 10-11rpm으로 설정합니다. THLE-3 스페로이드의 경우 11-12rpm으로 설정합니다.
   알림: 회전 속도는 스페로이드가 생물반응기 중앙에 고르게 분포되어 있고 벽에 닿지 않을 때 올바르게 설정됩니다. 도 2e는 회전하는 바이오리액터를 나타낸다.
8. 10mL의 오래된 배지를 제거하고 10mL의 새 배지로 교체하여 2-3일마다 성장 배지를 교환합니다. 매체를 교환할 때 스페로이드를 제거하지 마십시오(그림 2B).
   알림: 미디어 교환 루틴(예:ample, 48시간/48시간/72시간) 자세한 기록을 보관합니다.
9. 미디어가 바뀔 때마다 회전 속도를 조정합니다. 스페로이드의 크기와 수가 증가함에 따라 속도를 높입니다.
10. 배양한 지 15일 후, 스페로이드를 두 개의 새로운 생물반응기로 분리합니다.
    참고: 세포주와 성장 속도에 따라 시간이 달라질 수 있으므로 개별적으로 최적화해야 합니다.
11. 20일이 지나면 스페로이드를 채취할 준비가 됩니다.

4. 스페로이드의 이미지 캡처 및 계수

참고: 스페로이드 계수에 대한 단순화된 파이프라인은 그림 3A에 나와 있습니다. 스페로이드 수 및 면적 측정(섹션 5)을 위해서는 3D 구조의 소형도를 평가하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 색상이 더 향상되는 데 기여하며, 이는 방법이 정확하기 위해 필요합니다.

1. 태블릿에 설치된 3D 앱을 엽니다.
2. 바이오리액터를 선택하고 스냅샷을 찍습니다.
   참고: 또는 사진을 찍을 수 있습니다. 다음 매개 변수를 고려해야 합니다.
   1. 생물 반응기 뒤에 검은색 배경을 놓습니다(생물 반응기 상자에 검은색 지지대가 제공됨).
   2. 셀 챔버에 빛 반사가 없는지 확인하십시오.
   3. 가능한 한 생물 반응기에 가깝게 사진을 찍습니다.
3. 피지(ImageJ)에서 사진 한 장을 엽니다.
4. 분석을 위해 그림을 준비합니다.
   1. [타원형 도구]를 선택합니다. 플러그 주위에 원을 그립니다.
   2. 키보드에서 삭제 를 클릭하여 원 안의 모든 항목을 검은색으로 만듭니다. 감방 주위에 원을 그립니다. 모든 스페로이드가 원 안에 있는지 확인하십시오.
5. 매크로를 실행하여 스페로이드 계산:
   1. Plugins > Macro > Record를 클릭합니다. Supplementary File 1의 매크로 텍스트를 레코더로 복사합니다.
   2. 만들기를 누르면 새 창이 열립니다. 실행을 눌러 열린 사진을 분석합니다.
   3. 결과(개수, 전체 면적, 평균 크기 및 백분율 면적)가 포함된 새 창이 열립니다.
6. 이미지를 닫고 스페로이드 수가 필요한 각 이미지에 대해 4.4단계와 4.5단계를 반복합니다. 더 쉽고 빠르게 처리하려면 매크로를 저장하고 플러그인(Plugins) > 매크로(Macro) > 실행(Run ) 을 클릭하고 저장된 매크로를 선택하여 실행합니다.

5. 스페로이드 영역의 평면 측정

알림: 스페로이드 영역을 결정하기 위한 단순화된 파이프라인은 그림 3B에 나와 있습니다.

1. 3.5단계에 설명된 대로 이미지를 촬영합니다.
2. 시작하기 전에 스페로이드의 면적을 측정하기 위해 글로벌 스케일을 설정합니다.
   1. 피지에서 원하는 배율의 눈금 막대가 있는 그림을 엽니다. 선 도구를 선택합니다. 축척 막대 위에 그립니다(선은 축척 막대만큼 길어야 함).
   2. 분석을 열고 척도 설정을 >. 알고 있는 거리를 씁니다(선의 길이는 픽셀 단위의 거리에 자동으로 입력됩니다. 글로벌을 선택해야 합니다.
   3. OK를 누릅니다. 이제 분석 할 그림에 대한 척도가 설정되었습니다.
3. 평면도 측정을 시작하려면 매크로(보충 파일 2)를 실행합니다.
   1. Batch > 매크로> 프로세스를 클릭합니다. 분석할 사진이 들어 있는 폴더를 선택합니다. 이 폴더는 입력이 됩니다.
   2. 5.3.1단계에서 생성한 폴더를 [Output]으로 선택합니다. 프로세스를 누릅니다.
4. 품질 검사로 측정된 스페로이드 영역이 원본 이미지와 일치하는지 평가합니다.
   알림: 매크로는 스페로이드의 일부만 측정할 수 있는 가장자리의 스페로이드를 제외합니다.

6. 스페로이드 수집

참고: 스페로이드는 3D 구조를 보존하기 위해 넓은 보어 팁을 사용하여 수집하는 것이 좋습니다. 수집은 바이오리액터 전면에 있는 플러그를 사용하여 수행할 수 있습니다(그림 2A).

수집 시 스페로이드의 크기는 세포주, 시작 세포 수 및 분할 과정(배양 일수, 바이오리액터당 스페로이드 수 및 분할 비율)에 따라 달라질 수 있습니다.

1. 스페로이드를 수집하려면 긴 바늘에 연결된 주사기를 사용하여 상단 포트를 통해 바이오리액터에서 5mL의 배지를 제거합니다. 스페로이드가 생물 반응기의 하단 중앙(하단 포트 근처)으로 가라앉도록 하십시오.
2. 전면 포트를 열고 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 수집합니다. 스페로이드를 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 스페로이드를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 배지를 버립니다.
3. 200μL의 HBSS로 스페로이드를 세척하여 FBS를 제거합니다. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
4. 스페로이드 펠릿을 액체 질소로 스냅 얼리고 처리할 때까지 -80°C에서 보관합니다.

7. 스페로이드의 생존력

참고: 스페로이드 생존율은 손상된 세포에 의해 방출되는 아데닐레이트 키나아제(AK)의 활성을 측정하여 측정되었습니다(그림 4A). 확산 구배로 인해 AK 측정은 스페로이드가 직경이 900μm보다 작을 때 효율적입니다¹². 스페로이드가 더 커지거나 생존도 측정에 대해 의심이 가는 경우 ATP 분석을 수행할 수 있습니다¹⁵.

1. 스페로이드 상층액을 수집하고 20μL를 96웰 백색 벽 플레이트(평평한 바닥 투명)로 옮깁니다. 각 웰에 100μL의 아데닐레이트 키나아제 검출 시약을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균질화합니다.
2. RT에서 2분 동안 속도 진공에서 원심분리하여 기포를 제거합니다. RT에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 플레이트를 광도계(플레이트 리더, 발광 모드)에 놓고 프로그램을 시작합니다. 키트 제조업체의 지침에 따라 매개변수를 설정합니다.
   참고: 생물 발광 생존도 분석에서 직접 광도계 광 출력(일반적으로 RLU)을 사용하여 세포 반응을 계산할 수 있습니다. 아데닐레이트 키나아제는 세포 무결성이 손상된 세포에서만 누출되기 때문에 용해 시약을 사용하여 아데닐레이트 키나아제를 완전히 제어할 수 있습니다.

8. 단백질 추출

참고: 그림 1B 는 스페로이드 처리 및 단백질 추출을 위한 워크플로우를 나타냅니다.

1. 36일째에 스페로이드(섹션 6)를 수집합니다. 세포를 용해하기 위해 5% SDS의 25μL에 스페로이드를 재현탁시킵니다.
   1. 5% SDS를 첨가한 후 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 균질화합니다. 스페로이드를 용해하기 어려운 경우에는 작은 유봉을 사용하십시오.
2. 단백질을 줄이기 위해 1시간 동안 20mM DTT로 샘플을 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
3. 40mM 요오도아세트아미드로 30분 동안 단백질을 빛으로부터 보호하여 단백질을 알킬화합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
4. 12% 인산 용액(10x)을 최종 농도 1.2%로 샘플에 추가합니다.
5. 샘플을 6 부피의 결합 완충액으로 희석하고 부드럽게 혼합합니다.
6. 샘플을 S-Trap 필터 플레이트에 로드하고 500 x g 에서 30초 동안 스핀 다운합니다.
   참고: 8.4단계에서 샘플의 총 부피가 컬럼 부피 용량을 초과하는 경우 샘플을 배치로 로드하고 모든 것이 컬럼을 통과할 때까지 8.6단계를 반복합니다.
7. 150μL의 결합 완충액으로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세탁 후 500 x g 에서 30초 동안 회전하고 흐름을 버립니다.
8. 37°C에서 밤새 50mM 중탄산 암모늄에 희석한 1μg의 염기서열분석 등급 트립신으로 샘플을 배양합니다.
   참고: 최소 20μg의 단백질은 포괄적인 단백질체 분석을 위한 출발 물질로 권장됩니다. 이를 위해 1μg의 트립신은 효율적인 소화를 위한 이상적인 양입니다. 버퍼와 컬럼 베드 사이의 기포를 제거합니다.
9. 펩타이드를 40μL의 50mM 중탄산암모늄으로 용출하고 동일한 수집 튜브에 고입니다.
10. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 0.1% TFA의 40μL로 펩타이드를 용리하고 동일한 수집 튜브에 합합니다.
11. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 펩타이드를 40μL의 60% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 용출하고 동일한 수집 튜브에 합칩니다.
12. 500 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 고속 진공에서 고인 용리액을 건조시키고 처리할 때까지 샘플을 -80°C에서 보관합니다.

9. 샘플 정리

참고: 단백질체학 분석을 진행하기 전에 샘플에 존재하는 염을 제거해야 합니다. 염은 전기 분무 중에 이온화되어 펩타이드의 신호를 억제하기 때문에 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석법(HPLC-MS) 분석을 방해할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 탈염 설정은 이전에 Joseph-Chowdhury와 동료들에 의해 입증되었습니다¹⁶.

1. 시작하기 전에 다음 단계에서 흐름을 수집할 수 있는 깨끗한 96웰 수집 플레이트가 있는지 확인하십시오. C18 수지(100% 아세토니트릴에 50mg/mL)를 자석 교반 플레이트에 혼합합니다.
2. 96웰 필터 플레이트의 웰당 70μL의 C18 수지 현탁액을 추가하고, C18 수지가 피펫 바닥에 고이지 않도록 신속하게 수행합니다.
3. 튀지 않도록 진공 청소기를 부드럽게 켜십시오. 96웰 수집 플레이트에 수집된 플로우 스루를 폐기합니다.
4. 0.1% TFA의 100μL로 수지를 세척합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켜고 흐름을 버리십시오.
5. 각 샘플을 0.1% TFA의 100μL에 재현탁시킵니다. pH가 2-3 사이인지 확인하고 확인하십시오.
6. 각 샘플을 필터 플레이트의 각 웰에 로드합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켜고 흐름을 버리십시오.
7. 100μL의 0.1% TFA로 세척합니다. 샘플이 튀거나 섞이는 것을 방지하기 위해 진공 청소기를 부드럽게 켭니다. 흐름을 버리십시오.
8. 96웰 수집 플레이트를 새 96웰 플레이트로 교체하여 염이 제거된 샘플을 수집합니다.
9. 웰당 60μL의 아세토니트릴/0.1% TFA를 추가합니다. C18 수지에서 샘플을 용리하려면 물이 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다.
10. 흐름을 모으고 RT의 속도 진공에서 건조합니다. LC-MS/MS로 진행하거나 샘플을 처리할 준비가 될 때까지 플레이트를 -80°C에서 보관합니다.

10. 질량분석법과 결합된 액체 크로마토그래피를 통한 단백질체학 분석

참고: 이 원고의 데이터를 생성하기 위해 300μm ID x 0.5cm C18 트랩 컬럼과 75μm ID x 25cm C18-AQ(3μm) 분석 나노 컬럼이 사내에 충전된 2열 시스템 설정이 있는 nLC-MS/MS 시스템을 사용했습니다.

1. HPLC에서 실행할 이동상을 준비합니다.
   이동상 A(MPA): HPLC 등급 물에 포함된 0.1% 포름산
   이동상 B(MPB): HPLC 등급 아세토니트릴의 0.1% 포름산
2. HPLC 분석법을 다음과 같이 프로그래밍합니다: 4분 동안 34%-120% MPB, 34분 동안 90%-5% MPB, 5분 동안 등용매 90% MPB; 유량: 300nL/분
3. 검출된 펩타이드 신호의 MS/MS 스펙트럼을 생성하기 위해 데이터 독립적 수집(DIA)을 수행하도록 MS 수집 방법을 설정합니다.
4. 샘플을 nLC 자동 시료 주입기에 넣기 전에 10μL의 0.1% TFA에 1μg의 시료를 재현탁시킵니다.
5. 표준 단백질체학 획득을 위해 프로그래밍된 대로 nLC-MS 분석법을 실행합니다.
   1. 120,000(200m/z에서)의 분해능과 125의 자동 이득 제어(AGC) 목표치로 orbitrap에서 전체 MS 스캔을 300-1100m/z로 설정합니다.
   2. AGC 타겟이 400이고 고에너지 충돌 분해(HCD) 에너지가 30인 50m/z의 순차 분리 윈도우를 사용하여 orbitrap에서 MS/MS를 설정합니다.

11. 데이터 분석

1. nLC-MS/MS 원시 데이터 파일을 사용된 MS 플랫폼과 호환되는 피크 검출 소프트웨어로 가져옵니다.
2. 적절한 데이터베이스(사람, 마우스 등)를 선택합니다.
3. N-말단 아세틸화를 가변 변형으로 설정하고 카르바미도메틸 시스테인을 고정 변형으로 설정합니다.
4. 트립신(trypsin)을 소화 효소로 지정하고 두 개의 절단을 놓치면 됩니다.
5. 스펙트럼 획득에 사용되는 질량 분석기에 따라 질량 허용 오차를 설정합니다.
6. 분석을 스프레드시트로 내보내고 필요에 따라 데이터를 추가로 처리합니다.

결과

이 프로토콜에서는 3D 스페로이드 배양을 위해 특별히 설계된 시스템인 혁신적인 스트레스 없는 3D 세포 인큐베이터의 특성을 설명합니다(그림 2). THLE-3 및 HepG2/C3A 세포주의 3D 배양을 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 사용이 간편하며 바이오리액터당 > 100개의 스페로이드를 재현성 있고 비용 효율적으로 배양할 수 있습니다. 생물반응기에 들어가면 스페로이드는 2D 배양에서 유지되는 세포와 유사하게 처리됩니다. 최적의 성장 조건은 일주일에 2-3회 배지를 교환하고(그림 2B) 스페로이드의 성장과 크기에 따라 회전 속도를 조정함으로써 얻을 수 있습니다(그림 2C). 회전하는 바이오리액터에서 3D 스페로이드를 배양하는 이 시스템(그림 2E,F)은 스페로이드를 동일하고 매우 낮은 전단력에 노출시켜 3D 구조를 위한 최적의 성장 환경을 제공합니다.

우리는 이전에 스페로이드가 염색질 변형¹⁶의 분석에 어떻게 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 여기에서는 간 스페로이드를 얻는 방법과 전체 단백질체 분석을 위해 단백질체학 실험을 수행하는 방법을 자세히 보여줍니다(그림 1). 간단히 말해서, 프로토콜은 배양이 80% 밀도에 도달할 때까지 THLE-3 또는 HepG2/C3A 편평 세포를 사용하여 시작되었습니다. 세포를 스페로이드로 배양하기 위해 약 2,000개의 세포를 마이크로웰이 포함된 초저 부착판에 도금하여 자가 응집할 수 있도록 한 다음 형성된 스페로이드를 바이오리액터로 옮겼습니다(그림 1A). 스페로이드는 배양 후 3주 후에 기능적으로 활성화되지만, 앞서¹⁷번 설명한 바와 같이 이 프로토콜에 대해 배양 36일 후 수집된 스페로이드의 결과를 보여줍니다. 채취 후, 스페로이드를 회전시키고, 분석을 위해 펠릿과 상층액을 모두 저장하였다. 세포 생존율은 앞서 설명한 바와 같이, 손상된 세포에 의해 방출되는 아데닐레이트 키나아제의 정량화를 위해 상층액으로부터 평가하였다¹⁷. 세포 펠릿에서 세포 단백질을 추출하고, 전체 단백질체를 고분해능 질량분석법으로 분석했습니다(그림 1B).

이 프로토콜은 또한 공개 이미지 처리 프로그램인 FIJI(Fiji Is Just ImageJ)¹⁸를 사용하여 스페로이드 계수를 위한 반자동 방법(그림 3A)을 보여줍니다. 분석을 위해 스페로이드의 좋은 품질의 사진을 찍어야 하며 섹션 5에서 언급한 대로 일부 매개변수를 고려해야 합니다. 그런 다음 분석을 위해 그림을 준비한 후 매크로 스크립트(보충 파일 1)를 사용하여 스페로이드를 계산합니다. 매크로는 먼저 스페로이드 그림이 있는 폴더 안에 FIJI Spheroids counting이라는 폴더를 만들어 작동합니다. 이 폴더에는 분석의 모든 정보가 저장됩니다. 여기에는 각 스페로이드의 ID 번호와 함께 계산된 스페로이드의 사진이 포함됩니다. 여기에는 스페로이드 카운팅이라는 Excel 파일도 포함되어 있습니다. 이 파일에는 계산된 각 회전 타원체의 픽셀 영역과 ID 번호가 포함되어 있습니다. 분석된 사진 하나에 해당하는 데이터가 파일의 각 탭에 표시됩니다. 탭은 분석된 그림의 이름에 따라 레이블이 지정됩니다. 스페로이드 크기는 혈관 내 구조물의 수와 약물 처리를 포함한 여러 요인에 의해 손상될 수 있으므로 표면적을 모니터링하는 것도 중요합니다(planimetry). 여기에 제시된 매크로 스크립트(보충 파일 2)는 그림의 스페로이드에 해당하는 검은색 영역을 측정하여 작동합니다(그림 3B). 출력은 각 회전 타원체의 측정된 면적, 둘레 및 직경을 포함하는 planimetry.xlsx 파일에 수집됩니다. 직경을 계산하는 데 사용되는 Feret이라는 측정도 있습니다. Feret은 가능한 가장 긴 직경이고 minFeret은 가장 짧은 직경입니다. 직경은 이 둘의 평균입니다. 출력 폴더 안에는 planimetry.xlsx 파일 외에도 측정된 스페로이드의 그림도 있습니다.

단백질체 분석을 진행하기 전에 배양 시간 동안 스페로이드의 생존력을 평가했습니다. AK의 수준은 17일째까지 증가하여 세포 사멸의 약 7%에 도달한 다음 사멸은 5% 미만 수준으로 감소하며(그림 4A), 이는 이전에 발표된 연구¹⁷에 따릅니다. 이 프로토콜은 또한 세포 표현형을 모니터링하기 위한 전체 단백질체 분석을 보여줍니다. 먼저, THLE-3 및 HepG2/C3A 편평 세포와 스페로이드의 단백질체를 비교했습니다. 첫 번째 주성분(PC1)을 분석하면 편평 세포 배양에서 스페로이드 샘플이 엄격하게 분리되어 있음이 분명하며 세포 유형(THLE-3 및 HepG2/C3A)의 상관관계는 관련이 없는 것으로 보입니다(그림 4B). THLE-3 및 HepG2/C3A 스페로이드는 함께 뭉치지 않지만 간 기능과 일치하는 유사한 프로필을 공유합니다. 우리는 이 프로토콜에서 간에서 수행되는 금속 해독에 중요한 역할을 하는 메탈로티오네인의 예를 보여줍니다. 단백질체학 분석에서 편평 세포(MT1E 및 MT1X)와 비교하여 스페로이드에서 과발현되는 2개의 동형을 확인했습니다(그림 4C). 또한 스페로이드로 성장한 두 세포주의 유전자 온톨로지(GO) 농축을 보여줍니다. 트리카르복실산 회로(TCA 회로), 전자 전달 사슬(세포 호흡) 및 피루브산 대사로 구성된 탄수화물 대사 과정은 자주 사용되는 용어이며 HepG2/C3A 및 THLE-3 스페로이드가 풍부합니다(그림 4D,E). 세포 해독, 지방산 및 콜레스테롤 대사는 두 스페로이드에 풍부하게 함유된 다른 기능입니다. 이러한 기능은 간 기능에 매우 중요한 것으로 알려져 있습니다.

그림 1: 스페로이드 배양 및 시료 전처리를 위한 워크플로우 . (A) 3D 세포 배양 실험 접근법. 원하는 밀도에서 편평한 세포 배양을 트립신화하고 세포가 스페로이드로 자체 조립되는 마이크로웰을 포함하는 초저 부착 24웰 플레이트에 파종했습니다. 24시간 후, 스페로이드를 생물반응기로 옮기고 분석이 준비될 때까지 배양하였다. (B) 수집 후, 스페로이드를 펠릿화하고 펠릿과 배양 상층액을 모두 처리할 때까지 저장하였다. 히스톤¹⁶및 비히스톤 단백질을 추출하고, 펩타이드로 절단하고, 고분해능 질량분석법으로 분석하였다. 질량 분석법에서 얻은 원시 파일을 인간 데이터베이스와 비교하여 검색하고 데이터를 추가로 처리했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 3D 세포 배양 시스템 . (A) 생물 반응기 부품. 바이오리액터는 물 비드가 들어 있는 가스 교환 및 가습 챔버와 배지 교환 및 스페로이드 수집을 위한 두 개의 플러그가 있는 개방 가능한 셀 챔버로 구성됩니다. (B) 생물반응기 매체 교환. 바이오리액터는 바늘이 있는 주사기를 사용하여 10mL의 성장 배지로 채워집니다. (C) 시스템 제어 앱. 회전 속도, CO2 수준, 온도, 알람 로그 및 기타 기능은 제어 장치를 사용하여 제어할 수 있습니다. (D) 바이오리액터를 3D 인큐베이터에 배치하는 단계. 각 생물반응기에는 생물반응기를 천천히 회전시킬 수 있는 관련 모터가 있습니다. (E) (C) 정제에 의해 제어되는 속도(rpm)로 움직이는 생물반응기. 속도(rpm)는 스페로이드의 크기에 따라 조정됩니다. (F) 내부 생물반응기 de 3D 인큐베이터. 3D 인큐베이터는 최대 6개의 개별 제어 바이오리액터를 장착할 수 있습니다. 사진 제공: Jason Torres Photography. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 이미지 캡처를 통한 스페로이드의 표현형 특성 분석 . (A) 반자동 스페로이드 수. 생물반응기에서 스페로이드의 스냅샷을 촬영한 후 FIJI에서 분석할 수 있도록 이미지를 준비합니다. 각 스페로이드가 계산되고 각각에 대한 ID 번호가 제공됩니다. 매크로가 사용되며, 계산된 스페로이드의 ID, 레이블(분석된 그림의 이름) 및 영역(스페로이드에서 계산된 픽셀 수)을 보여주는 결과가 표시됩니다. (B) 스페로이드 면적의 평면 측정. 매크로를 사용하여 특정 회전 타원체의 면적, 둘레 및 직경을 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 간 스페로이드의 단백질체 분석. (A) 스페로이드의 생존율은 배양 상층액에 대한 아데닐레이트 키나아제(AK)의 방출을 기반으로 계산되었습니다. 결과는 중복 데이터 포인트의 수단± SD입니다. (B) THLE-3 및 HepG2/C3A 편평 세포 및 스페로이드의 단백질체를 비교하기 위해 주성분 분석(PCA)을 수행했습니다. (C) 인간의 간에서 발현되는 단백질인 메탈로티오닌의 상대적 풍부함. 데이터는 SEM± 수단으로 표시됩니다. (D) 기능적으로 그룹화된 네트워크는 HepG2/C3A 스페로이드 및 (E) THLE-3 스페로이드에 대한 GO 농축을 보여주며, 여기서 그룹당 가장 중요한 용어의 레이블만 표시됩니다. 네트워크는 ClueGo¹⁹를 사용하여 구성되었습니다. 노드 크기는 보강 유의성이라는 용어를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 스페로이드 계수를 위한 매크로 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 스페로이드 평면도 측정을 위한 매크로. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

3차원(3D) 세포 구조 이면의 생물학을 이해하는 것은 그 기능에 대한 보다 포괄적인 지식을 위해 매우 중요합니다. 복잡한 생물학을 연구하고 독성 스크리닝을 수행하기 위해 3D 모델을 사용하는 것에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 3D로 세포를 배양할 때는 모델 시스템의 표현형 평가를 포함하여 많은 요소를 고려해야 합니다. 표현형은 형태학, 행동, 생리학적 및 생화학적 특성과 같은 특정 유기체의 관찰 가능한 특성의 그룹으로 정의된다²⁰.

이 프로토콜에서는 몇 가지 스페로이드에서 단백질체학 실험을 수행하고 일반적인 간 표현형을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 질량 분석법은 3D 세포 특성 분석에 광범위하게 적용되는 방법이 되어 다양한 생물학적 질문 12,16,21,22을 조사할 수 있습니다. 포괄적인 단백질체 분석을 위해서는 최소 20μg의 단백질 출발 물질을 사용하는 것이 좋으며, 이 중 1μg을 질량분석기에 주입하는 것이 좋습니다. 더 적은 수의 샘플을 추가하면 감도가 손실될 수 있으며, 더 많은 샘플을 추가하면 크로마토그래피의 품질이 점차 악화되어 결국 컬럼이 막힐 수 있다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 우리는 HepG2/C3A 및 THLE-3 스페로이드가 특정 간 경로이며 혈당 수치를 유지하고 에너지 생산에 중요한 해당과정과 TCA 회로의 중요한 단백질로 풍부하다는 것을 보여주었습니다^23,24. 실제로, 질량 분석 분석은 단백질 수준의 정보를 제공할 뿐만 아니라 이전에 그룹¹⁶에서 보여준 바와 같이 단백질 번역 후 변형을 조사할 수 있습니다.

3D 표현형 연구에서 고려해야 할 또 다른 측면은 스페로이드의 수와 크기입니다. 실험의 재현성을 높이는 것 외에도 용기 내 3D 구조의 수가 스페로이드의 크기와 대사 활동 수준에 영향을 미칠 수 있으므로 배양을 여러 바이오리액터로 분할할 시기를 결정하기 위해서는 스페로이드의 수를 계산하고 크기를 결정하는 것이 필수적입니다. 그러나 스페로이드의 수와 크기는 세포주, 시작 세포 수, 분할 과정 및 수집 시간에 따라 달라진다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 스페로이드당 세포 수, 단백질 함량 및 연령 함수로서의 크기와 같은 HepG2/C3A 스페로이드 배양에 대한 세부 정보는 Fey, Korzeniowska 및 Wrzesinski²⁵에 의해 제공되었습니다. 여기에 설명된 반자동 방법을 사용하여 정확하고 성공적인 분석을 위해 가장 중요한 단계는 스페로이드의 사진을 잘 보는 것입니다. 간단히 하기 위해 휴대폰이나 태블릿으로 사진을 찍을 수 있지만 해상도는 가능한 한 높게 유지해야 합니다. 이미지를 빠르게 획득할 수 있기 때문에 대규모 스크리닝 실험을 통해 특정 표현형 특징을 시각화하거나 약물 치료에 대한 반응을 조사할 수 있습니다. 그러므로, 세포 기반 분석의 증가로 인해, 지난 10년 동안 이미지 분석을 위한 다수의 오픈 소스 소프트웨어가 개발되었다²⁶. 이 프로토콜에서는 소프트웨어 FIJI¹⁸ 을 사용하여 스페로이드의 크기를 계산하고 측정하는 반자동 시스템을 설명합니다. 이미지 컬렉션에 적용할 수 있는 일련의 알고리즘 작업을 정의하는 스크립트(간단한 프로그래밍 명령)를 제공하여 분석을 쉽고 빠르게 수행할 수 있도록 했습니다. 그러나 스페로이드의 특성에 따라 수동 측정을 사용해야 합니다. 예를 들어, 스페로이드가 너무 반투명하면 FIJI 스크립트가 정확하지 않습니다. 그건 그렇고, 이 방법이 작동하는 가장 중요한 기준 중 하나는 스페로이드의 소형화입니다. 이 특성은 스페로이드와 배경 사이의 색상 대비를 더욱 향상시키는 데 기여하며, 이는 방법이 정확하기 위해 필요합니다.

요약하면, 재현성이 높은 스페로이드를 성장시키기 위한 방법론을 제시하는 것 외에도 이미지 캡처 및 단백질체학을 통한 표현형 특성 분석과 결합된 반자동 시스템도 설명되었습니다. 3D 세포 분석을 위한 이 도구 상자는 완전 자동화된 이미지 분석 소프트웨어와 차세대 질량 분석기를 통해 더욱 강력해질 것으로 기대합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 mL syringe	Fisher Scientific	1481754	Luer lock tip, graduated to 12 mL
1000 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222703
200 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222730
96-well Orochem filter plate	Orochem	OF1100
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C
96-well vacuum manifold	Millipore	MAVM0960R
Ammonium bicarbonate	Sigma	A6141-25G
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)	Lonza	CC-3170
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	N/A	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar incubator	CelVivo	N/A	CO2 incubator for 3D cell culture
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells	Corning	4441
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Formic acid	Thermo	28905
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
hEGF	Corning	354052
HERAcell vios 160i	Thermo	51033557	CO2 incubator for 2D cell culture
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25015CI
Non-essential amino acids	Fisher Scientific	MT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µm	Waters	186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
PAULA microscope	Leica
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	MT3002CI
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader	PerkinElmer
pH paper	Hydrion	93
Phosphoetanolamine	Sigma	P0503
Phosphoric acid	Fisher Scientific	A260-500
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Refrigerated centrifuge	Thermo	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size
SDS	Bio-Rad	1610301
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V511A
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo	1375
Sterile serological pipettes	Fisher Scientific	1367549
S-trap	Protifi	C02-micro-80
Syringe needle (18 G)	Fisher Scientific	14817100	3" length, 0.05" diameter
Trifluoroacetic acid (TFA)	Thermo	28904
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Vortex	Sigma	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10