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* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.
단일 분자 자기 핀셋(MT)은 핵산 및 단백질과 같은 생체 분자를 강력하게 조사하는 강력한 도구 역할을 하므로 기계 생물학 분야에서 유용할 태세입니다. 이 방법은 일반적으로 마그네틱 비드의 이미지 기반 추적에 의존하기 때문에 이미지 기록 및 분석의 속도 제한과 비드의 열 변동으로 인해 표적 분자의 작고 빠른 구조적 변화를 관찰하는 데 오랫동안 적용이 방해를 받았습니다. 이 글에서는 생체 분자 및 그 복합체의 나노 단위, 밀리초 역학을 해결할 수 있는 고분해능 MT 설정의 구성 및 작동에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 응용 사례로서, DNA 헤어핀과 SNARE 복합체 (막 융합 기계)를 사용한 실험이 시연되며, 피코 네톤 규모의 힘이있을 때 일시적인 상태와 전이를 어떻게 감지 할 수 있는지에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 고속 MT가 세포에서 힘을 감지, 전송 및 생성하는 분자에 대한 고정밀 나노 역학 측정을 계속 가능하게 하여 기계 생물학에 대한 분자 수준의 이해를 심화할 것으로 기대합니다.
세포는 기계적 자극을 능동적으로 감지하고 반응합니다. 그렇게 함으로써 많은 생체 분자는 역동적인 구조적 변화를 가능하게 하는 힘 의존적 특성을 나타냅니다. 잘 알려진 예로는 세포에 주변 환경의 주요 기계적 정보를 제공하는 기계에 민감한 이온 채널과 세포골격 요소가 있습니다.
또한, 독특한 힘을 지닌 성질을 나타내는 분자는 더 넓은 의미에서 기계에 민감한 것으로 간주 될 수 있습니다. 예를 들어, 핵산 이중가닥의 국소 형성 및 용융뿐만 아니라 G-사중가닥과 같은 고차 구조는 복제, 전사, 재조합, 그리고 최근에는 게놈 편집에서 중요한 역할을 합니다. 또한, 시냅스 통신에 관여하는 일부 신경 단백질은 일반적인 분자간 상호 작용 수준을 초과하는 물리적 힘을 생성하여 기능을 수행합니다. 어떤 예를 연구하든, 높은 시공간 정밀도로 관련된 생체 분자의 나노 역학을 조사하는 것은 관련 기계 생물학적 과정 1,2,3의 분자 메커니즘을 밝히는 데 매우 유용하다는 것을 증명할 것입니다.
단일분자 힘 분광법은 생체분자 2,4,5,6의 기계적 성질을 조사하는 강력한 도구로 사용되어 왔다. 그들은 힘의 적용과 동시에 핵산과 단백질의 구조적 변화를 모니터링하여 힘 의존적 특성을 조사할 수 있습니다. 잘 알려진 두 가지 설정은 광학 핀셋과 자기 핀셋(MT)으로, 미크론 크기의 비드를 사용하여 분자 5,6,7,8을 조작합니다. 이러한 플랫폼에서 폴리스티렌(광학 핀셋용) 또는 마그네틱 비드(MT용)는 일반적으로 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 짧은 단편으로 구성된 분자 "핸들"을 통해 표적 분자(예: 핵산 및 단백질)에 연결됩니다. 그런 다음 비드를 움직여 힘을 가하고 이미지를 작성하여 표적 분자의 구조적 변화를 보고하는 위치를 추적합니다. 광학 핀셋과 자기 핀셋은 응용 분야에서 크게 상호 교환할 수 있지만 힘을 제어하는 접근 방식에는 중요한 차이점이 있습니다. 광학 핀셋은 본질적으로 비드를 제자리에 가두는 위치 클램프 도구로, 대상 구조물이 모양 변화를 겪을 때 가해지는 힘이 변동하기 때문입니다. 펼침과 같은 확장 증가는 밧줄을 느슨하게 하고 장력을 감소시키며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 광학 핀셋의 힘을 제어하기 위해 능동 피드백을 구현할 수 있지만, MT는 환경 섭동에도 견딜 수 있는 영구 자석에 의한 안정적인 원거리 자기력을 활용하여 자연스럽게 힘 클램프 장치로 작동합니다.
오랜 역사와 단순한 설계에도 불구하고 MT는 고속 비드 추적의 기술적 문제로 인해 고정밀 측정에 대한 응용 분야에서 광학 핀셋에 비해 뒤쳐져 있습니다. 그러나 최근 여러 그룹이 공동으로 MT 기기 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19의 하드웨어와 소프트웨어의 다각적인 개선을 주도하고 있습니다 . 이 연구에서는 1.2kHz에서 실행되는 이러한 설정의 예를 소개하고 이를 사용하여 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노역학적 측정을 수행하는 방법을 설명합니다. 모델 시스템으로서 우리는 DNA 헤어핀과 뉴런 SNARE 복합체를 사용하고 피코네톤 체계에서 빠르고 구조적인 변화를 조사합니다. DNA 헤어핀은 잘 정의된 힘 범위20,21에서 간단한 2-상태 전이를 나타내므로 핀셋 설정의 성능을 검증하기 위한 장난감 모델 역할을 합니다. SNARE 단백질이 막 융합을 구동하는 힘에 민감한 복합체로 조립됨에 따라(22), 이들은 또한 단분자 힘 분광법(single-molecule force spectroscopy)에 의해 광범위하게 연구되었다 14,23,24,25. 데이터를 분석하고 열역학 및 동역학에 대한 유용한 정보를 추출하는 표준 접근 방식이 제시됩니다. 우리는 이 기사가 기계생물학 연구에서 고정밀 MT의 채택을 촉진하고 독자들이 자신의 힘에 민감한 관심 시스템을 탐색하도록 동기를 부여할 수 있기를 바랍니다.
이 프로토콜에 설명 된 모든 재료와 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 아래에 설명된 고속 MT 설정을 작동하기 위한 LabVIEW 소프트웨어와 샘플 데이터를 분석하기 위한 MATLAB 스크립트는 GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers)에 보관되어 공개적으로 사용할 수 있습니다.
1. 장치의 구성
참고: 고속 MT 구조의 일반적인 원리는 고속 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라와 고출력 코히어런트 광원을 사용한다는 점을 제외하면 기존의 표준 MT 시스템과 유사합니다(그림 1). 표준 MT 기기 5,26,27에 대한 자세한 설명은 다른 출처를 참조하십시오.
2. 자기력의 교정
3. DNA 헤어핀의 합성
참고: MT 실험을 위한 DNA 헤어핀 구조는 두 개의 맞춤형 프라이머를 사용하여 λ-DNA에서 510bp 영역의 PCR 증폭에 의해 준비되며, 그 중 하나는 5′-말단에 헤어핀 구조를 포함합니다(그림 3A). 이러한 방식으로, 헤어핀 모티프가 PCR 산물의 한쪽 끝에 배치된다.
4. SNARE 단백질의 제조
참고: 신경 SNARE 복합체는 대장균에서 발현된 세 가지 정제된 쥐 단백질인 VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A 및 SNAP-25를 결합하여 조립됩니다(그림 3B). 이들의 조립을 용이하게 하기 위해 신택신과 SNAP-25는 VAMP2 단편(N-말단 영역이 없음, "ΔN-VAMP2"라고 함)과 함께 "ΔN-복합체"라고 하는 구조로 공동 발현된 다음 DNA 핸들 부착 후 전장 VAMP2와 혼합되어 전체 복합체를 형성합니다.
5. DNA 손잡이 부착
참고: 한쪽 끝에 1차 아민기를 포함하는 2개의 510bp dsDNA 핸들을 먼저 PCR로 준비한 다음 아민기를 이기능성 가교제인 SM(PEG)2를 사용하여 말레이미드기로 전환합니다. 그런 다음 두 개의 핸들은 부위 특이적 접합을 위해 시스테인 그룹을 통해 SNARE 복합체에 공유 결합됩니다(그림 3B).
6. 플로우 셀의 제작
참고: MT 측정을 위한 플로우 셀은 양면 테이프로 결합된 두 개의 유리 커버슬립으로 구성됩니다(그림 3C). 하나의 커버슬립은 PEG와 비오틴화 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 혼합물로 코팅되어 비특이적 결합을 방지하고 비오틴-뉴트르아비딘 결합을 통해 표적 분자의 특이적 테더링을 가능하게 합니다(그림 3D). 그런 다음 MT 실험을 위한 재료 용액을 주사기 펌프를 사용하여 플로우 셀에 순차적으로 주입합니다(그림 3C,D).
7. 비드-테더 구조물의 조립
참고: 비드-테더 구조용 용액을 포함하여 MT 실험용 재료 용액은 주사기 펌프를 사용하여 플로우 셀에 순차적으로 도입됩니다(그림 3C,D).
8. 표적 구조물의 식별
9. 확장 측정을 위한 비드 추적
참고: 비드 트래킹은 본 기사와 함께 제공되는 LabVIEW 소프트웨어에서 비드 이미지를 실시간으로 분석하여 수행됩니다. 트래킹 방법 및 그 변형들은 종래의 MT 시스템의 대부분에서 사용되어 왔으며, 이전의 문헌 2,5,7,26에 설명되어 있다. 고정된 기준 비드에 대한 자기 비드의 위치를 측정함으로써(즉, 차동 추적), 위치 측정은 외부 섭동에 대해 매우 견고해집니다.
10. 강제 적용 계획
11. 데이터 분석
참고: MT 데이터로 수행할 수 있는 분석 유형은 대상 시스템에 따라 다릅니다. 그러나 그림 4에 설명된 각 실험에서 유용한 정보를 추출하는 일반적인 방법이 있습니다. 모든 분석은 이 글에서 제공하는 사용자 지정 코드를 사용하여 MATLAB (R2021a)로 수행됩니다. 이러한 코드는 이 문서에 제시된 것과 동일한 데이터를 사용하여 플롯을 생성합니다. 100Hz 추적의 원시 데이터는 분석을 위해 직접 가져왔지만 1.2kHz 추적의 데이터는 일반적으로 노이즈를 줄이기 위해 분석 전에 중앙값 필터링(5포인트 슬라이딩 윈도우 포함)되었습니다(노이즈 분석 제외).
힘 교정
두 가지 힘 측정 방법(비드의 측면 변위 분산 및 전력 스펙트럼 분석)의 결과는 0-2pN 차이가 났습니다(그림 2G). 그림 2F의 결과에 따르면 일반 네오디뮴 자석으로 최대 30pN에 안정적으로 도달할 수 있습니다.
8bp DNA 헤어핀의 2상태 전이
우리는 먼저 짧은 DNA 헤어핀의 나노 역학을 조사했습니다 (
이 연구에서 우리는 높은 시공간 정밀도에서 생체 분자의 구조적 변화를 관찰할 수 있는 단일 분자 힘 분광법 설정을 도입했습니다. 사용된 고속 CMOS 카메라는 1,280 x 1,024 해상도에서 1,200 프레임 s-1 을 획득하여 1.2kHz 비드 트래킹을 가능하게 합니다. 그러나 측정 속도는 현재 비드 추적 소프트웨어에 의해 제한되므로 고속 측정에서 ROI는 일반적으로 더 작은 영역으로 감소합니다. SLD의 고?...
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 한국 정부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 및 NRF-2021R1A6A1A10042944)의 지원을 받았습니다. S.-H.R. NRF 보조금(2021R1C1C2009717)의 지원을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for construct synthesis | |||
Agarose gel electrophoresis system | Advance | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Bioneer | D-1037 | |
nTaq polymerase | Enzynomics | P050A | |
PCR purification kit | LaboPass | CMR0112 | |
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 | ThermoFisher Scientific | 22102 | For SNARE–DNA coupling |
Primer B | Bioneer | 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For 5-kbp force calibration construct and DNA handles |
Primer B_hp | IDT | 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For hairpin construct |
Primer N | Bioneer | 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' | For DNA handles |
Primer Z | Bioneer | 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For DNA handles |
Primer Z_5k | Bioneer | 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3' | For 5-kbp force calibration construct |
Primer Z_hp | Bioneer | 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' | For hairpin construct |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
λ-DNA | Bioneer | D-2510 | Template strand for PCR |
DNA sequences for SNARE proteins | |||
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 | homemade | ggggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag 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SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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Materials for protein purificaiton | |||
2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-25ML | |
Agar | LPS Solution | AGA500 | |
Ampicillin, Sodium salt | PLS | AC1043-005-00 | |
Chloramphenicol | PLS | CR1023-050-00 | |
Competent cells (E. coli) | Novagen | 70956 | Rosetta(DE3)pLysS |
Glycerol | SIGMA | G5516-500ML | |
HEPES | SIGMA | H4034-100G | |
Hydrochloric acid / HCl | SIGMA | 320331-500ML | |
Imidazole | SIGMA | I2399-100G | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG | SIGMA | 10724815001 | |
Kanamycin Sulfate | PLS | KC1001-005-02 | |
Luria-Bertani (LB) Broth | LPS Solution | LB-05 | |
Ni-NTA resin | Qiagen | 30210 | |
PD MiniTrap G-25 (desalting column) | Cytiva | GE28-9180-07 | For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174 |
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF | ThermoFisher Scientific | 36978 | |
Plasmids for SNARE proteins | cloned in house | N/A | Available upon request |
Protease inhibitor cocktail | genDEPOT | P3100 | |
Sodium chloride | SIGMA | S5886-500G | |
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 | SIGMA | S7907-100G | |
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 | SIGMA | S3139-250G | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP | SIGMA | C4706-2G | |
Trizma base | SIGMA | T1503-250G | |
Materials for sample assembly | |||
Biotin-PEG-SVA | LAYSAN BIO | BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g | For PEGylation |
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 | SIGMA | 761540-10MG | For bead coating |
Double-sided tape | 3M | 136 | For flow cell assembly |
Epoxy glue | DEVCON | S-208 | For flow cell assembly |
Glass coverslip for bottom surface | VWR | 48393-251 | Rectangular, 60×24 mm, #1.5 |
Glass coverslip for top surface | VWR | 48393-241 | Rectangular, 50×24 mm, #1.5 |
Magnetic bead | ThermoFisher Scientific | 14301 | Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm |
mPEG-SVA | LAYSAN BIO | mPEG-SVA 1g | For PEGylation |
N,N-Dimethylformamide / DMF | SIGMA | D4551-250ML | For bead coating |
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine | SIGMA | 104884-100ML | For PEGylation |
Neutravidin | ThermoFisher Scientific | 31000 | For sample tethering |
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 | PLS | PR2007-100-00 | |
Plastic syringe | Norm-ject | A5 | 5 ml, luer tip |
Polyethylene Tubing | SCI | BB31695-PE/4 | PE-60 |
Reference bead | SPHEROTECH | SVP-30-5 | Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm |
Syringe needle | Kovax | 21G-1 1/4'' | 21 G |
Syringe pump | KD SCIENTIFIC | 788210 | |
Equipment for magnetic tweezer instrument | |||
1-axis motorized microtranslation stage | PI | M-126.PD1 | For vertical positioning of magnets |
2-axis manual translation stage | ST1 | LEE400 | For alignment of magnets to the optical axis |
Acrylic holder for magnets | DaiKwang Precision | custum order | Drawing available upon request |
Frame grabber | Active Silicon | AS-FBD-4XCXP6-2PE8 | |
High-speed CMOS camera | Mikrotron | EoSens 3CXP | |
Inverted microscope | Olympus | IX73P2F-1-2 | |
Neodymium magnets | LG magnet | ND 10x10x12t | Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed |
Objective lens | Olympus | UPLXAPO100XO | Oil-immersion, NA 1.45 |
Objective lens nanopositioner | Mad City Labs | Nano-F100S | |
Rotation stepper motor | AUTONICS | A3K-S545W | For rotating magnets |
Superluminescent diode | QPHOTONICS | QSDM-680-2 | 680 nm |
Software | |||
LabVIEW | National Instruments | v20.0f1 | |
MATLAB | MathWorks | v2021a |
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