Micro-CT 영상 및 생쥐 신생아 뇌의 형태 분석

요약

이 연구는 생체 외 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)과 조영제를 결합하여 신생아 마우스 뇌의 고해상도 이미지를 얻는 단계를 설명합니다. 우리는 이러한 이미지에서 뇌 크기와 모양을 정량화하기 위한 기본 형태 분석을 설명합니다.

초록

신경 영상은 동물 모델을 사용한 실험에서 뇌 형태를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 자기공명영상(MRI)은 연조직의 표준 방법이 되었지만, 공간 해상도가 낮아 작은 동물에게는 한계가 있습니다. 여기서는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)을 사용하여 생쥐 신생아 뇌 및 두개골에 대한 고해상도 3차원(3D) 정보를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 샘플을 해부하고, 뇌를 염색 및 스캔하고, 전체 장기 및 관심 영역(ROI)의 형태 측정 측정값을 얻는 데 필요한 단계가 포함됩니다. 이미지 분석에는 구조의 분할과 점 좌표의 디지털화가 포함됩니다. 요컨대, 이 연구는 조영제로서 마이크로 CT와 Lugol의 용액을 조합하는 것이 작은 동물의 주산기 뇌를 이미징하는 데 적합한 대안임을 보여줍니다. 이 이미징 워크플로우는 발달 생물학, 생물의학 및 다양한 유전적 및 환경적 요인이 뇌 발달에 미치는 영향을 평가하는 데 관심이 있는 기타 과학에 적용됩니다.

서문

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 영상은 다양한 연구 분야에 유용한 도구입니다. 생물학에서는 광물화 된 조직의 X 선 흡수로 인해 뼈 연구에 특히 적합합니다. 이러한 특성으로 인해, 뼈 발달(bone development)¹, 신진대사(metabolism)², 진화(evolution)^3,4 등에 관한 다양한 질문들이 micro-CT의 도움을 받아 접근되었다. 2008년 de Crespigny 등은 요오드를 조영제로 사용하여 성체 쥐와 토끼 뇌의 마이크로 CT 이미지를 얻을 수 ^{있음을 보여주었습니다.} 이 작업은 요오드가 X선에 둔감한 연조직으로부터 이미지를 획득할 수 있게 해주었기 때문에 이 이미징 기술에 대한 새로운 응용 프로그램을 열었습니다. 따라서 마이크로 CT와 요오드 기반 조영제를 결합하는 일반적인 목표는 중조직 또는 거시 해부학적 수준에서 연조직을 구별하고 식별할 수 있는 고해상도 이미지를 얻는 것입니다.

이 기술은 실험 설계에 널리 사용되는 마우스 배아....

프로토콜

모든 실험 절차는 캐나다 동물 보호 위원회의 지침을 따랐습니다.

1. 시료 채취 및 준비

1. 4% 파라포름알데히드(PFA) 500mL를 준비합니다.
   1. 캐비닛의 추출 플럭스에서 1L 유리 비커에 있는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 250mL에 PFA 분말 20g을 추가합니다. 자석이 있는 비커를 자석 교반판에 놓습니다.
   2. 가열하면서 저어줍니다. 온도계를 사용하여 용액의 온도를 지속적으로 확인하여 60 °C 미만으로 유지하십시오.
   3. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액에 1M NaOH 방울을 추가하여 PFA를 용해시킵니다. PFA 분말이 완전히 용해되면 용액을 실온(RT)에서 식힙니다.
   4. 1x PBS를 사용하여 용량을 500mL로 조정합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 7.2M HCl 방울을 추가하여 pH를 7.3-1로 조정합니다.
   5. 종이 필터와 유리 깔때기를 사용하여 1L 유리병에 용액을 여과합니다.
   6. 유리병을 닫고 플럭스 캐비닛에서 꺼낸 다음 -4°C의 냉장고에 보관합니다.
2. 뇌 샘플을 수집합니다.
   1. 샘플을 얻기 위해 희생 쥐 신생아는 출생 다음날....

토론

이 연구에서는 조영제가 있는 마이크로 CT를 사용하여 생쥐의 신생아 뇌 조직을 스캔하는 간결한 프로토콜을 소개합니다. 또한 정량적 및 정성적 출력을 얻기 위한 간단한 절차가 포함되어 있습니다. 이러한 방법을 기반으로 추가 대체 또는 보완 분석을 수행할 수 있습니다.

프로토콜에서 볼 수 있듯이 마이크로 CT 이미지는 다양한 방식으로 분석할 수 있습니다. 이전 연구에?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650