소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

요약

본 프로토콜은 오일 레드 O를 사용하여 지질 방울(LD)을 염색하고, 지방산 유도 지방 간세포 모델에서 LD의 크기와 수를 계산하고, BODIPY 493/503을 사용하여 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정을 관찰하는 방법을 설명합니다.

초록

지질 방울(LD)은 세포의 지질 대사와 중성 지질 저장에 중요한 역할을 하는 세포 소기관입니다. 그들은 비만, 지방간 질환 및 당뇨병과 같은 다양한 대사 질환과 관련이 있습니다. 간세포에서 LD의 크기와 수는 지방간 질환의 징후입니다. 또한, 산화 스트레스 반응, 세포 자가포식 및 세포자멸사는 종종 LD의 크기와 수의 변화를 동반합니다. 결과적으로, LD의 크기와 양은 LD 생물 발생의 메커니즘에 관한 현재 연구의 기초입니다. 여기에서는 지방산 유발 소 간 세포에서 오일 레드 O를 사용하여 LD를 염색하고 LD의 크기와 수를 조사하는 방법을 설명합니다. LD의 크기 분포는 통계적으로 분석됩니다. 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정은 라이브 셀 이미징 시스템에서도 관찰됩니다. 현재의 연구는 다양한 생리적 조건에서 LD의 크기 변화 추세를 직접 관찰할 수 있는 방법을 제공합니다.

서문

간세포에 지질 액적(LD) 축적은 간 섬유증 및 간세포 암종으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 전형적인 특징입니다. 지방간 질환의 가장 초기 증상은 간세포¹의 세포질에 LD가 축적되는 것을 특징으로하는 지방증이라는 것이 밝혀졌습니다. 간 지방증은 항상 LD의 수 증가 및/또는 크기 증가와 관련이 있다². LD는 중성지방(TG)을 핵심으로 하는 소포체(ER)에서 생성되는 것으로 생각되며, 단백질과 인지질로 둘러싸여 있다³. LD는 TG 저장을 담당하는 세포내 소기관으로서 크기, 수, 지질 조성, 단백질 및 다른 소기관과의 상호 작용과 관련하여 다양한 특징을 나타내며, 이 모든 것이 세포 에너지 항상성에 영향을 미칩니다⁴. TG 수준은 LD의 크기와 양의 상관관계가 있으며, 세포 내 TG 함량이 높을수록 더 큰 LD를 형성할 수 있다⁵. LD는 TG의 국소 합성, ER에서의 지질 혼입 및 다중 LD의 융합을 통해 크기가 증가한다⁶. 큰 LD를 포함하는 세포(지방세포, 간세포 등)는 LD 융합에 의해 효율적으로 지질 저장....

프로토콜

모든 절차는 허난농업대학교(중국 허난성) 동물관리위원회의 윤리적 기준에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1. 소 간세포 배양

1. 1차 간세포¹⁷ 을 해동하고 실온에서 4분 동안 400 x g 의 원심분리를 실시한다.
   참고: 일차 간세포 세포는 이전에 발표된 보고서¹⁷에 따라 배양 및 유지되었다.
2. 냉동 보관 용액을 피펫으로 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)이 포함된 배지 1mL로 현탁합니다. 다음으로, 세포 계수 챔버를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 계산한 다음 위의 세포 현탁액의 농도를 계산하고 세포 농도를 1 x 10⁷ cells/mL로 조정합니다.
   1. 상기 배지 3 mL가 들어 있는 60 mm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 넣는다. 세포를 배양하고, 37°C 및 5%_CO2 에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
3. 세포가 80%까지 성장하면 배지를 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹군 다음 750μL의 0.25....

토론

병리학 적 상태에 따라 간 LD는 크기와 수에 엄청난 변화를 겪습니다. LD는 간세포 세포에 널리 존재하며 간 건강과 질병에 중요한 역할을 한다¹⁸. LD의 양과 크기는 LD의 생물 발생에 대한 현재 연구의 기초입니다¹⁹. 세포와 조직의 LD의 크기와 수는 에너지를 저장하고 방출하는 능력을 반영합니다. LD의 동적 변화는 지질 대사 활동의 안정성을 유지합니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent