단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부

요약

선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.

초록

선조체 혈관에 의해 생성되는 내와우 전위는 적절한 유모 세포 기계 형질도입과 궁극적으로 청력에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 필수적입니다. 선조체 혈관의 병리는 청력 저하를 초래할 수 있습니다. 성인 선조체 혈관의 해부는 집중된 단일 핵 포획 및 후속 단일 핵 시퀀싱 및 면역 염색을 허용합니다. 이러한 기술은 단일 세포 수준에서 선조체 혈관 병태생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

단일 핵 시퀀싱은 선조체 혈관의 전사 분석 설정에 사용할 수 있습니다. 한편, 면역염색은 특정 세포 집단을 식별하는 데 계속 유용합니다. 두 방법 모두 전제 조건으로 적절한 선조체 혈관 박리가 필요하며, 이는 기술적으로 어려울 수 있습니다.

서문

달팽이관은 3개의 유체로 채워진 챔버, 스칼라 현관, 스칼라 중막 및 스칼라 고막으로 구성됩니다. 스칼라 현정과 스칼라 고막은 각각 고농도의 나트륨(138mM)과 낮은 농도의 칼륨(6.8mM)을 함유하고 있는 외림프를 함유하고 있습니다.¹. 스칼라 배지는 고농도의 칼륨 (154 mM)과 낮은 농도의 나트륨 (0.91 mM)을 갖는 내 림프를 함유하고 있습니다 ^1,2,3. 이러한 이온 농도의 차이는 달팽이관 내 전위(EP)라고 할 수 있으며, 주로 달팽이관 4,5,6,7,8,9,10,11의 측벽을 따라 선조체 혈관(SV)의 다양한 이온 채널과 간극 접합부를 통한 칼륨 이온의 이동에 의해 생성됩니다

프로토콜

모든 동물 실험 및 절차는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 청각 장애 및 기타 의사소통 장애 연구소에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 난청 및 기타 의사소통 장애 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용위원회와 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders)의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 안락사

1. 체중이 15-20g인 C57BL/6J 또는 Kcnj10-ZsGreen 형질전환 마우스, 출생 후 30+(P30+)를 사용하십시오.
2. 성인 마우스(P30세 이상)를 승인된 프로토콜(여기서는_CO2 질식)을 사용하여 안락사시킨다. 2 차 단계로 참수를 수행하십시오.
   참고: 면역염색의 경우 일부 항체는 SV의 모세혈관에서 혈....

토론

단일 세포 시퀀싱이 등장하기 전에 많은 연구자들은 벌크 조직 분석을 사용하여 세포 전체에 걸쳐 평균화된 전사체만 분석할 수 있었습니다. 특히, single-cell 및 sNuc-Seq는 각각 단일 세포 또는 단일 핵의 전사체를 분리하는 것을 가능하게 하였다³². 이 경우, 단일핵 전사체는 방추 세포(³⁰) 뿐만 아니라 변연, 중간 및 기저 세포에 대해 확인될 수 있다. 이를 통해 SV ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections