유세포 분석에서 보상 대조군으로 사용하기 위한 포르피린 변형 비드

요약

이 프로토콜은 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 포르피린 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC의 반응에 의해 유세포 분석을 위한 포르피린 기반 보상 비드를 준비하는 방법을 설명합니다. 미립자 부산물을 줄이기 위해 여과 절차가 사용됩니다.

초록

유세포 분석은 형광 측정을 기반으로 다양한 세포 집단을 신속하게 특성화하고 정량화할 수 있습니다. 세포는 먼저 하나 이상의 형광 시약으로 염색되며, 각각은 세포 표면 항원 발현과 같은 표현형 특성에 따라 세포에 선택적으로 결합하는 상이한 형광 분자(형광단)로 기능화됩니다. 세포에 결합된 각 시약의 형광 강도는 지정된 파장 범위를 감지하는 채널을 사용하여 유세포 분석기에서 측정할 수 있습니다. 여러 형광단을 사용하는 경우 개별 형광단의 빛이 원치 않는 검출 채널로 흘러 들어가는 경우가 많으며, 이는 보상이라는 프로세스에서 형광 강도 데이터를 수정해야 합니다.

보상 제어 입자, 일반적으로 단일 형광단에 결합된 폴리머 비드는 세포 표지 실험에 사용되는 각 형광단에 필요합니다. 유세포 분석기의 보상 입자 데이터는 형광 강도 측정에 보정을 적용하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 형광 시약인 메조테트라(4-카르복시페닐) 포르핀(TCPP)과 공유 작용화된 폴리스티렌 보상 비드의 준비 및 정제와 유세포 분석 보상에서의 적용에 대해 설명합니다. 이 작업에서, 아민 작용화 폴리스티렌 비드를 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염)로 pH 6 및 실온에서 16시간 동안 교반하면서 처리했습니다. TCPP 비드를 원심분리에 의해 단리하고, 보관을 위해 pH 7 완충액에 재현탁시켰다. TCPP 관련 미립자는 부산물로 관찰되었습니다. 이러한 미립자의 수는 선택적 여과 프로토콜을 사용하여 줄일 수 있습니다. 생성된 TCPP 비드는 다중 형광단으로 표지된 인간 객담 세포를 사용한 실험에서 보상을 위해 유세포 분석기에서 성공적으로 사용되었습니다. TCPP 비드는 냉장고에 300일 동안 보관한 후 안정적인 것으로 입증되었습니다.

서문

포르피린은 형광 및 종양 표적화 특성으로 인해 생물 의학 분야에서 수년 동안 관심의 대상이었습니다 ^1,2,3. 광역학 요법(PDT) 및 초음파 요법(SDT)과 같은 치료 적용은 암 환자에게 포르피린의 전신 투여, 종양에 약물 축적, 특정 파장 또는 초음파의 레이저 광에 대한 종양의 국소 노출을 수반합니다. 레이저 광선 또는 초음파에 노출되면 포르피린에 의한 활성 산소 종의 생성과 그에 따른 세포 사멸이 일어난다 ^4,5. 광역학 진단(photodynamical, PDD)에서 포르피린 형광은 암세포와 정상세포를 구별하는 데 사용된다⁶. 이러한 맥락에서, 전구체 인 5- 아미노 레불린 산 (5-ALA)의 전신 또는 국소 주사시 종양에 축적되는 천연 형광 포르피린 인 protoporphyrin IX는 위장관 간질 종양, 방광암 및 뇌암을 확인하는 데 사용됩니다 ^7,8. 최근에는 다발성....

프로토콜

모든 절차는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.

1. TCPP 원액의 제조, 1.0 mg/mL

참고: 매월 준비할 수 있습니다.

1. 분석 저울, 주걱 및 계량 용지를 사용하여 49.0-50.9mg의 TCPP를 계량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다. 측정된 TCPP 양을 빛으로부터 보호해 두십시오.
   알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오.
2. 1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 정제수 및 이소프로판올(IPA)의 필요한 양을 결정합니다. 정제수와 이소프로판올을 100mL 유리 비커에 넣고 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 덮습니다.
3. 1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 필요한 중탄산나트륨의 양을 결정합니다.
4. 분석 저울, 주걱 및 칭량지를 사용하여 1.3단계에서 결정된 필요한 양의 중탄산나트륨을 칭량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다.
   알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오.
5. 정제수와 이소....

토론

암 진단 및 치료학에 포르피린이 많이 적용되고 있음에도 불구하고², 일차 인간 조직에서 암성 대 비암성 세포 집단을 식별하기 위한 유세포 분석 시약으로서의 포르피린의 잠재적 용도에 대한 문헌은 제한적이다^24,25,26. 인간 객담^24,27의 유세포 분석에 대한 우리의.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365