Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

요약

액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.

초록

액틴 및 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력("악토미오신 수축성")은 세포 분열, 세포 이동, 상피 접힘 및 분지 형태 형성과 같은 여러 길이 척도에서 세포 및 조직의 형태학적 변화에 중요합니다. 형태 형성에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 기존의 유전적 또는 약리학적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 악토미오신 수축의 신속한 비활성화를 허용하는 접근 방식을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜은 정확한 시간 및 공간 제어로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 억제하기 위해 CRY2-CIBN 기반 광유전학적 이합체화 시스템인 Opto-Rho1DN의 사용을 보여줍니다. 이 시스템에서 CRY2는 Rho1(Rho1DN)의 우세한 음성 형태에 융합되는 반면 CIBN은 원형질막에 고정됩니다. CRY2 및 CIBN의 청색광 매개 이량체화는 세포질에서 원형질막으로 Rho1DN의 빠른 전좌를 초래하며, 여기서 내인성 Rho1을 억제하여 악토미오신 비활성화를 초래합니다. 또한, 이 기사는 초파리 복부 고랑 형성 동안 상피 긴장을 생성하는 악토미오신의 역할을 조사하기 위해 악토미오신의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 레이저 절제를 결합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최소한의 수정으로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 포함하는 다른 많은 형태학적 과정에 적용할 수 있습니다. 전반적으로, 이 광유전학적 도구는 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학을 제어하는 악토미오신 수축성의 기능을 해부하는 강력한 접근 방식입니다.

서문

액토미오신 수축성(actomyosin contractility)은 F-액틴 네트워크에서 비근육 미오신 II(이하 '미오신')에 의해 가해지는 수축력으로, 세포 형태를 변화시키고 조직 수준의 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나이다 ^1,2. 예를 들어, 상피 세포의 정점 도메인에서 악토미오신 수축성의 활성화는 정단 수축을 초래하며, 이는 상피 접힘, 세포 압출, 박리 및 상처 치유를 포함한 다양한 형태 형성 과정을 촉진합니다 3,4,5,6,7 . 미오신의 활성화는 그의 조절 경쇄의 인산화를 필요로 한다. 이 변형은 미오신 분자의 억제 형태를 완화하여 양쪽 끝에 여러 헤드 도메인이 있는 양극성 미오신 필라멘트 다발을 형성할 수 있도록 합니다. 양극성 미오신 필라멘트는 액틴 필라멘트의 역평행 운동을 유도하고 수축력 ^1,8,9

프로토콜

1. 유전자 십자가 설정 및 난자 채취 컵 준비

1. 광유전학적 계통 UASp-CIBNpm(I)에서 암컷 파리(처녀)를 선택합니다. UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)를 입체현미경 하의_CO2 패드 상에서 모체 GAL4 드라이버 라인 67 Sqh-mCherry로부터 수컷 파리와 교배시키고; 15 E-카데린-GFP.
   참고: 67과 15는 각각 두 번째(II) 및 세 번째(III) 염색체에 삽입된 모체-Tubulin-GAL4를 나타냅니다(⁵²). 이 프로토콜에 사용된 GAL4 라인은 또한 mCherry 태그된 미오신 조절 경쇄 Sqh(스파게티 스쿼시)³⁷ 및 GFP 태그가 붙은 E-cadherin⁵³을 발현합니다. 광유전학적 계통의 파리는 여전히 FM7 및 TM6 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다. 모체 GAL4 드라이버 라인의 파리는 여전히 CyO 및 TM3 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다.
2. ~10일 후, 다음 유전자형을 갖는 F1 암컷 파리를 선택합니다: UASp-CIBNpm/+; 67제곱미터체리/+; 15 E-카데린-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mC....

토론

이 프로토콜은 악토미오신 수축성이 비활성화된 직후 조직 장력의 변화를 조사하기 위해 광유전학과 레이저 절제의 병용을 설명했습니다. 여기에 설명된 광유전학적 도구는 Rho1(Rho1DN)의 지배적인 음성 형태를 이용하여 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 급격히 억제합니다. 초파리 복부 고랑 형성의 맥락에서 Opto-Rho1DN의 이전 특성화는 이 도구가 동시 미오신 불활성화 및 액틴 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation