암세포의 이온 채널 스크리닝

요약

이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

초록

이온 채널은 세포 발달과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 이온 채널 기능의 섭동은 광범위한 장애 또는 채널병증의 발병에 기여합니다. 암세포는 이온 채널을 활용하여 자체 발달을 유도할 뿐만 아니라 종양으로 개선되고 다양한 비암성 세포를 포함하는 미세 환경에서 동화됩니다. 또한, 종양 미세 환경 내에서 성장 인자 및 호르몬 수준의 증가는 이온 채널 발현을 향상시켜 암세포 증식 및 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 이온 채널의 약리학적 표적화는 원발성 및 전이성 뇌암을 포함한 고형 악성 종양을 치료하는 유망한 접근 방식일 수 있습니다. 본원에서는 암 세포에서 이온 채널의 기능을 특성화하기 위한 프로토콜과 암 생존력에 미치는 영향을 결정하기 위해 이온 채널의 조절자를 분석하는 접근법을 설명합니다. 여기에는 이온 채널에 대한 세포 염색, 미토콘드리아의 편광 상태 테스트, 전기 생리학을 사용하여 이온 채널 기능 확립, 약물 효능을 평가하기 위한 생존력 분석 수행이 포함됩니다.

서문

막 수송 단백질은 세포 간의 통신과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 막 수송 단백질 중에서 이온 채널은 세포의 성장과 발달을 촉진하고 도전적이고 변화하는 환경에서 세포의 상태를 유지하는 역할을 합니다. 이온 채널은 또한 전신 및 중추신경계(CNS)에서 고형 종양의 발달을 유도하고 지원하는 것으로 보고되었습니다^1,2. 예를 들어, KCa3.1 채널은 세포 주기 조절에 중요한 막 전위를 조절하고 세포 부피를 조절하는 역할을 합니다. 결함이 있는 KCa3.1 채널은 종양 세포의 비정상적인 증식에 기여하는 것으로 보고되었다³. 또한, 이온 채널은 암의 전이성 전파에 기여할 수 있습니다. 일시적인 수용체 전위 (TRP) 채널은 예를 들어 Ca2+ 및^Mg2+ 유입에 관여하고; 이 유입은 종양을 둘러싼 세포외 기질을 조절하는 기능을 하는 여러 키나아제와 열 충격 단백질을 활성화시키며, 이는 차례로 암 전이를 시작하는 데 중요합니다⁴.

이온 채널은 암 발병에 기여할 수 있기 때문에 약물 관련 암 치료의 표적이 될 수도 있습니다. ....

프로토콜

1. 배양된 세포의 면역표지 이온 채널

1. 세포 준비 및 실험 설정
   1. 세포를 75^cm2 배양 플라스크에서 활발하게 성장하는 배양물로 유지한다. 사용 중인 세포주의 배가 시간에 따라 50%-90% 합류할 때까지 세포를 한 번 계대합니다.
      참고: 본 연구를 위해, 그룹 3 수모세포종 세포주인 D283 세포를 사용하였다.
   2. 배양 플라스크에서 세포를 원심분리기 튜브(15mL 또는 50mL)에 모으고 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가하여 부착 세포를 분리합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 5 분 후 플라스크를 3-5 번 두드려 세포를 분리합니다. 세포를 10% FBS와 함께 10mL의 배지에 모아 트립신의 작용을 중지시킨다.
   3. RT에서 480 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 매체를 부드럽게 흡인합니다. 세포 펠릿을 방해하지 마십시오.
   4. 배양물의 밀도에 따라 5 mL 내지 10 mL의 배지에서 세포를 재현탁한다.
      참고: 밀도는 활발하게 성장하는 세포와 일치해야 하며 플라스크 내 세포의 밀도에 따라 달라집니다. 최적의 세포 밀도를 근사화하기 위해 시각적 평가를 사용해야 합니다. 특히, 셀은 40%-90% 사이에 합류하고 고르게 분포되어야 합니다.
   ....

토론

이온 채널 기능의 변화는 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 변경하여 세포의 전반적인 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 지난 10년 동안 이온 채널이 암세포 성장과 전이에 중요하다는 것이 점점 더 분명해졌습니다. 중요하게도, 많은 이온 채널이 광범위한 장애를 표적으로 하는 승인된 치료제의 주요 표적이다²⁴. 연구자들은 이온 채널이 항암 표적이 될 수 있는지 여부를 조사했으?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841