면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

요약

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

초록

염증성 장 질환의 병태생리학을 연구하고, 잠재적으로 유익한 물질의 약리학적 스크리닝을 위해, 잠재적으로 유해한 식품 성분에 대한 독성 연구를 위해 생체 내 및 체외 장 모델의 사용이 증가하고 있습니다. 관련하여, 동물 모델을 대체하기 위한 세포 기반 in vitro 모델의 개발에 대한 현재 수요가 있습니다. 여기서, 세포주를 사용하는 기본적인 "건강한 조직" 3차원(3D) 장 등가 모델에 대한 프로토콜은 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 시스템)과 생리학적 복잡성(U937 단핵구 및 L929 섬유아세포의 지지 면역 구성 요소를 가진 Caco-2 장세포)을 모두 제공하는 두 가지 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩도 포함되어 있어 단일 실험에서 여러 시각적 매개변수를 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편은 대조군 처리에서 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 Caco-2 원주 세포를 보여주는 데 사용되어 실험 시스템으로서 모델의 효능을 검증합니다. 글루텐을 전염증성 식품 성분으로 사용하여 단층 두께 감소, 기저 매트릭스(H&E)로부터의 파괴 및 분리, 오클루딘 염색에서 볼 수 있듯이 밀착 접합 단백질 발현 감소(통계적으로 정량화 가능), 분화 14(CD14) 염색 클러스터 및 대식세포로의 CD11b 관련 분화에서 입증된 U937 세포 이동의 면역 활성화가 절편에서 분석된 매개변수가 포함됩니다. 장 염증을 시뮬레이션하기 위해 지질다당류를 사용하여 알 수 있듯이 측정할 수 있는 추가 매개변수는 고정 전에 배지에서 추출할 수 있는 점액 염색 증가 및 사이토카인 발현(예: 미드키네)입니다. 기본적인 3차원(3D) 장 점막 모델 및 고정 절편은 여러 시각적 정량화 가능한 매개변수를 분석할 수 있는 가능성과 함께 염증 상태 및 장벽 무결성 연구에 권장될 수 있습니다.

서문

서로 다른 유형의 상피 세포를 포함하는 1 세포 두께의 내부 내막인 장 상피 장벽은 신체의 외부와 내부 환경 사이의 첫 번째 물리적 방어 장벽 또는 인터페이스를 구성합니다 ^1,2. 원주형 장세포는 가장 풍부한 유형의 상피세포를 구성합니다. 이들은 단단한 접합부(TJ)를 포함한 여러 장벽 구성 요소 간의 상호 작용을 통해 상피 장벽 무결성을 유지하는 역할을 하며, 장벽 강화에 중요한 역할을 합니다 ^1,3. TJ 구조는 조눌라 오클루덴스(zonula occludens, ZO) 및 싱귤린(cingulin)과 같은 세포내 플라크 단백질로 구성되며, 오클루딘(occludin), 클라우딘(claudin) 및 접합 접착 분자(junctional adhesion molecule, JAM)를 포함한 막관통 단백질과 협력하여 인접 세포를 단단히 연결하는 지퍼 모양의 구조를 형성합니다 ^3,4. 막관통 단백질은 작은 화합물의 수동 세포주위 확산을 조절하고 독성이 있는 큰 분자를 배제합니다.

프로토콜

1. 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비

알림: 전체 절차는 멸균 층류 후드에서 수행해야 합니다. 세포 인큐베이터 사용과 관련된 절차의 모든 단계는 배양액이 5%_CO2 를 함유한 가습 분위기에서 37°C에서 배양됨을 의미합니다(프로토콜에 달리 명시되지 않는 한_).

1. 장 모델 시스템에 사용되는 세포주의 사전 준비
   1. F25 플라스크에 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL에 5 x 10⁵ 농도의 L929 마우스 섬유아세포 세포를 종자하고 장 모델 제작 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 피펫을 사용하여 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 배지(5mL)를 넣고 세포를 48시간 동안 더 배양합니다.
      알림: 셀은 사용하기 전에 80% 합류해야 합니다.
   2. F75 세포 플라스크에 10mL의 DMEM 배지(10% FBS 및 1% Pen-Strep 포함)에 Caco-2 세포(2 x 10⁶ 농도)를 종자하고 장 점막 모델 구축 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48....

토론

여기에 제시된 기본 재구성 장 점막 모델 시스템(그림 6)은 생리학적 복잡성(섬유아세포 및 단핵구를 포함하는 ECM이 풍부한 lamina propria 지지체와 함께 Caco-2 단층을 포함하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 세포 배양)과 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 생산하기 위해 상업용 인간 세포주를 사용)을 결합합니다.¹³. 따라서 이 모델 시?.......