프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

요약

지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.

초록

중간엽 기질 세포(MSC)는 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 생성을 통해 염증을 강력하게 조절합니다. 이 세포는 프리온 질환 및 기타 단백질 접힘 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 맥락에서 신경 염증을 조절하는 능력을 보여줍니다. 프리온 질환은 산발적이거나, 후천적이거나, 유전적일 수 있습니다. 이는 뇌에서 프리온 단백질의 잘못된 접힘과 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 질병은 항상 치명적이며 사용할 수 있는 치료법이 없습니다.

질병의 초기 징후 중 하나는 성상교세포와 미세아교세포의 활성화 및 관련 염증으로, 이는 감지 가능한 프리온 응집과 신경 세포 손실 이전에 발생합니다. 따라서 MSC의 항염증 및 조절 특성을 수확하여 프리온 질환에서 성상교증을 치료할 수 있습니다. 최근에는 BV2 세포 또는 원발성 혼합 신경교세포와 함께 배양한 지방 유래 MSC(AdMSCs)가 파라크린 신호전달을 통해 프리온 유발 염증을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 논문은 프리온 유발 염증을 줄이기 위해 자극된 AdMSC를 사용하는 신뢰할 수 있는 치료법에 대해 설명합니다.

AdMSC의 이형접합 집단은 쥐 지방 조직에서 쉽게 분리하고 배양에서 확장할 수 있습니다. 염증성 사이토카인으로 이러한 세포를 자극하면 프리온에 감염된 뇌 균질화로 이동하고 이에 대한 반응으로 항염증 조절제를 생성하는 능력이 향상됩니다. 이러한 기법은 프리온 감염에 대한 MSC의 치료 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있으며 다른 단백질 접힘 및 신경 염증성 질환에도 적용할 수 있습니다.

서문

신경교세포 염증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온 질환 등 다양한 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 비정상적인 단백질 응집은 질병 발병 기전과 신경 퇴행의 많은 원인에 기인하지만, 신경교세포(glial cell)도 이 ^1,2,3을 악화시키는 역할을 합니다. 따라서 신경교세포 유발 염증을 표적으로 하는 것은 유망한 치료법입니다. 프리온 질환에서 세포 프리온 단백질(PrP^C)은 질병 관련 프리온 단백질(PrP^Sc)로 잘못 접혀 올리고머를 형성하고 응집하여 뇌의 항상성을 방해합니다 ^4,5,6.

프리온 질환의 초기 징후 중 하나는 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 염증 반응입니다. 미세아교세포(microglia)를 제거하거나 성상세포(astrocyte)를 변형시켜 이러한 반응을 억제하는 연구는 일반적으로 동물 모델에서 질병 발병기전을 개선하....

프로토콜

마우스는 콜로라도 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜 #1138에 따라 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International)의 인증을 받은 콜로라도 주립 대학의 실험실 동물 자원(Lab Animal Resources)에서 사육 및 유지되었습니다.

1. 프리온으로 원발성 피질 혼합 아교세포를 분리하고 감염시키는 것

1. 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)를 모두 포함하는 원발성 혼합교세포(primary mixed glia)를 분리하기 위해, 0일에서 2일 된 생쥐 새끼 C57Bl/6을 획득합니다.
   참고: 이 프로토콜은 이전 프로토콜 ^15,16에서 조정되었습니다.
2. 참수로 한 번에 한 마리씩 새끼를 안락사시키고 뇌를 추출하여 소뇌와 뇌간을 분리하고 폐기합니다.
   1. 2x 페니실린/스트렙토마이신/네오마이신(PSN)....

토론

여기에서는 신경교세포 모델에서 프리온 유발 염증을 감소시키는 지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSCs)의 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 상대적으로 저렴한 프로토콜을 보여줍니다. AdMSC는 배양에서 쉽게 분리하고 증식하여 1주일 이내에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역형광 및 유세포 분석에 의해 중간엽 기질 세포의 마커와 일치하는 마커를 발현하는 이종 세포 집단을 일관되게 생?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641