중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

요약

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

초록

중간엽줄기세포(MSC)를 이용한 기존의 골재생치료는 혈관신생을 유도하는 기전이 없기 때문에 임계치보다 큰 뼈결손에는 적용이 어렵다. MSC로 제작된 인공 연골 조직을 이식하면 내연골 골화(ECO)를 통해 생체 내 혈관신생 및 뼈 형성을 유도합니다. 따라서 이러한 ECO 매개 접근법은 미래에 유망한 뼈 재생 치료법이 될 수 있습니다. 이 ECO 매개 접근법의 임상 적용의 중요한 측면은 뼈 결함을 복구하기 위해 이식할 수 있는 충분한 연골을 준비하기 위한 프로토콜을 수립하는 것입니다. 특히 실제 뼈 결손의 모양과 일치하는 크기의 이식된 연골 덩어리를 설계하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식하는 연골은 여러 조각을 이식할 때 뼈를 일체로 형성하는 성질을 가져야 합니다. 하이드로겔은 임상적 요구 사항을 충족하기 위해 내연골 골화를 위한 조직 공학 이식편을 확장하는 데 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔이 in vitro 및 ECO in vivo에서 MSC 연골 형성을 지원하지만, 임상 응용 분야의 요구 사항을 충족하는 최적의 스캐폴드 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골 세포외 기질의 중요한 구성 요소이며 생분해성 및 생체 적합성 다당류입니다. 여기에서 HA 하이드로겔은 MSC 기반 연골 조직의 in vitro 분화를 지원하고 in vivo 내연골 형성을 촉진하는 우수한 특성을 가지고 있음을 보여줍니다.

서문

자가 뼈는 여전히 외상, 선천적 결함 및 외과적 절제로 인한 뼈 결함을 복구하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 자가 골 이식술은 기증자의 통증, 감염 위험, 환자로부터 분리할 수 있는 제한된 골량 등 상당한 한계가 있다 1,2,3,4. 천연 또는 합성 고분자를 인산칼슘 또는 하이드록시아파타이트 ^5,6과 같은 광물화 물질과 결합한 수많은 생체 재료가 뼈 대체품으로 개발되었습니다. 이러한 공학적 물질의 골 형성은 일반적으로 줄기세포가 막내 골화(intramembrane ossification, IMO) 과정을 통해 조골세포(osteoblast)로 직접 분화할 수 있도록 하기 위해 광물화된 물질을 프라이밍 물질로 사용하여 이루어진다⁷. 이 과정은 혈관신생 단계가 결여되어 이식편 후 이식편의 생체내 혈관화가 불충분하므로8,9,10 이러한 과정을 이용한 접근법은 큰 뼈 ....

프로토콜

이 프로토콜은 생후 4주 된 수컷 누드 마우스를 사용합니다. 22-24°C 및 50%-70% 상대 습도에서 12시간 명암주기 하에 케이지에 4마리의 쥐를 수용합니다. 모든 동물 실험은 도쿄 의과 치과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 지침(승인 ID: A2019-204C, A2020-116A, A2021-121A)에 따라 수행되었습니다.

1. 완충액 및 시약의 준비

1. MSC 기초 배지에 MSC 성장 배지의 보충 키트를 첨가하여 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSC growth medium)를 제조하고 4°C에서 보관합니다.
2. 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 겐타마이신, 200μM L-알라닐-L-글루타민 및 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자를 첨가하여 Dulbecco's Modified Eagle 배지 및 Ham's F12(DMEM/F-12) 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
3. 사용 직전에 DMEM에 1% ITS-G 보충제, 0.12% 소 혈청 알부민, 50μg/mL 겐타마이신, 0.35mM L-프롤린, 100nM 덱사메타손, 10ng/mL TGF-β3를 첨가하여 연골 배지를 준비합니다.
4. 사용 직전에 DME....

토론

비후성 연골에서 뼈로의 전환을 촉진하는 적절한 스캐폴드 재료를 사용하는 것은 MSC 기반 엔지니어링 비대성 연골 이식편을 확장하고 임상적으로 중요한 크기의 뼈 결함을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 여기에서, 우리는 HA가 시험관내에서 MSC 기반 비대성 연골 조직의 분화를 지원하고 생체내에서 내연골골 형성을 촉진하는 우수한 스캐폴드 물질임을 보여준다 ^38<.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332