인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

요약

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

초록

괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 심각하고 치명적일 수 있는 장 질환으로, 복잡한 발병 기전으로 인해 연구가 어려웠으며, 아직 완전히 이해되지 않고 있습니다. NEC의 병태생리학에는 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 상피 세포 사멸, 미생물 미생물 미생물 불균형 및 조절 장애 염증이 포함됩니다. NEC를 연구하는 전통적인 도구에는 동물 모델, 세포주, 인간 또는 생쥐의 장 오가노이드가 포함됩니다. 이러한 모델 시스템을 사용한 연구는 질병 병태생리학에 대한 현장의 이해를 향상시켰지만, 인간 NEC의 복잡성을 요약하는 능력은 제한적입니다. NEC-on-a-chip이라고 하는 미세유체 기술을 사용하여 NEC의 개선된 시험관 모델이 현재 개발되었습니다. NEC-on-a-chip 모델은 인간 내피 세포 및 중증 NEC를 앓고 있는 유아의 마이크로바이옴과 함께 배양된 조산아에서 유래한 장내 장내형 장내형 물질로 파종된 미세유체 장치로 구성됩니다. 이 모델은 NEC의 병태생리학에 대한 기계론적 연구를 위한 귀중한 도구이자 신생아 장 질환에 대한 약물 발견 테스트를 위한 새로운 리소스입니다. 이 원고에서는 NEC-on-a-chip 모델에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.

서문

괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 조산아에게 영향을 미치며, 체중 1500g < 출생아의 경우 발병률이 최대 10%에 이른다¹. NEC의 병태생리학은 복잡하며 장 상피의 손상, 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 면역 조절 장애 및 상피 세포 사멸을 포함합니다 ^2,3. NEC의 발병기전과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 이해는 불완전하며, 수십 년간의 연구에도 불구하고 효과적인 표적 치료법은 아직 없습니다.

NEC 연구의 진전을 가로막는 중요한 장벽은 인간 유아로부터 분리한 1차 장 조직의 가용성이 제한적이고 크기가 작다는 것입니다. NEC를 앓고 있는 영아의 장 조직을 절제하면 괴사하고 심하게 손상되는 경우가 많아 질병 발병 전 메커니즘에 대한 연구가 복잡해집니다. 예를 들어, NEC를 앓고 있는 영아의 소장에는 면역 세포가 넘쳐나며, 장 줄기세포의 수가 감소하고, 상피 세포 증식이 감소하며, 상피 세포 사멸이 증가한다 4,5,6,7.^....

프로토콜

엔테로이드는 NEC 또는 비염증성 병인이 있는 기타 장 질환에 대한 수술 시 얻은 미숙아(임신 22주에서 36주에 출생)의 소장 샘플에서 유래되었습니다. 모든 검체 채취 및 처리는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교(IRB 프로토콜 번호 201706182 및 201804040)와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(IRB 프로토콜 번호 21-3134)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)의 정보에 입각한 동의 및 승인을 받은 후 수행되었습니다.

1. 장내형 질환을 확립하기 위해 인간 신생아 소장에서 크립트의 분리 및 도금

1. 배지 준비
   1. 표 1에 설명된 대로 필요한 모든 매체를 준비합니다. 모든 매체 준비에 무균 기술이 사용되는지 확인하십시오. 필터: 0.2μm 필터를 사용하여 배지를 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
2. 장 조직 세척 및 다지기
   1. 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 얼음 위에 올려 해동합니다. 수술실에서 인간의 장 조직을 얻습니다. 즉시 샘플을 5mL의 얼음처럼 차가운 조직 세척 배지에 넣어 내인성 프로테아제를 비활성화합니다.
   2. 트리밍된....

토론

이 NEC-on-a-chip 시스템은 NEC의 병태생리학을 모델링하는 데 사용할 수 있는 강력한 새 도구입니다. 이 플랫폼은 연속적인 발광 흐름 및 스트레치가 있는 공동 배양 시스템을 통합하여 이전 모델보다 생체 내 장 내 환경과 더 유사한 복잡한 미세환경을 제공합니다. 이러한 조건은 성숙한 상피 하위 유형과 단단한 접합부로 구성된 고도로 편광된 상피가 늘어선 3D 융모와 같은 구조의 발달을 촉?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A