Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

요약

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

여기서는 변연 틈새 세포(LNC)의 분리 및 식별을 위한 표준 절차를 보고합니다. 안구 은행에서 얻은 림버스 조직을 LNC 분리에 사용했습니다. 조직을 무균 조건에서 12개의 조각으로 나누고, LNC 및 변연 상피 전구 세포가 있는 세포 클러스터를 얻기 위해 콜라겐분해효소 A를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 동안 절단했습니다. 세포 클러스터를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 15분 동안 추가로 절단하여 단일 세포를 얻은 후 5% Matrigel로 코팅된 플라스틱 표면에 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 배양했습니다. 세포는 70% 합류 시 통과되었으며 면역형광, 실시간 정량 PCR(qPCR) 및 유세포 분석을 사용하여 LNC를 식별했습니다. 1차 LNC는 12회 이상 격리 및 통과되었습니다. P4에서 P6까지 LNC의 확산 활동이 가장 높았습니다. LNC는 BMMSC보다 더 높은 줄기세포 마커를 발현했습니다(SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, PDGFRβ). 또한, P4 LNC는 VIM, CD90, CD105 및 PDGFRβ를 균일하게 발현하는 것으로 나타났지만, LNC 식별을 위한 마커로 사용할 수 있는 Pan-CK는 발현하지 않았습니다. 유세포 분석 결과, LNC의 약 95%, 97%, 92% 및 11%가 각각 CD73, CD90, CD105 및 SCF를 발현한 반면, BMMSC에서는 68%, 99%, 20% 및 3%였습니다. LNC 분리 및 식별을 위한 표준 공정은 LNC의 광범위한 사용을 위한 신뢰할 수 있는 실험실 기반을 제공할 수 있습니다.

서문

각막 감염 및 손상으로 인해 각막 상피 줄기세포 결핍증(LSCD)1이라고도 하는 각막 상피 줄기세포 결핍증(CESD)^과 각막 상피 재생(CES)의 발생률이 점점 더 시급해지고 있습니다. CESD를 제대로 치료하지 않으면 각막 이식이 필요한 실명으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, CES 재생이 더욱 중요해지고 있습니다. CES 기능에 필수적인 지원을 제공하는 LNC(limbal niche cell)라고 하는 지지 세포 그룹이 있습니다. Limbal stromal stem cell은 Polisetty et ^al.2에 의해 처음 분리되었고, Xie et ^al.3에 의해 limbus의 limbal epithelium subjacent 및 stroma에 국한된 LNC로 확인되었습니다. LNC는 각막 가장자리의 핵심 지원 줄기세포이며 골수 유래 MSC(BMMSC)의 기능을 가지고 있으며 각막 상피 세포 및 각막 기질 세포 등으로 발달하도록 유도될 수 있습니다.^3,4,5,6,7.

프로토콜

50세에서 60세 사이의 기증자로부터 림버스 조직을 Tongji Hospital(중국 우한)의 적십자 안구 은행에서 얻었습니다. 이 의정서는 통지 윤리위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

1. 격리

1. 중간 각막 보관 배지에서 연봉 조직을 얻고 매우 깨끗한 작업대에서 무균 조건에서 작업합니다.
2. 멸균 수술용 원형 칼날을 사용하여 각막 주변의 홍채와 내피를 긁어내고 제거합니다.
3. 각막과 공막의 양쪽에 1mm가 남은 수술용 칼날을 사용하여 변막 조직을 동일한 크기의 12개 조각으로 자릅니다.
4. 연엽 조직을 3.5cm 배양 플레이트에 옮기고 콜라겐분해효소 A 1mL(DF-12 배지 2mg/mL)를 추가하여 모든 조직을 소화를 위해 담급니다.
5. 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에 넣고 18시간 동안 윤부 조직을 소화합니다.
   알림: 후속 절차는 일반적으로 둘째 날에 수행됩니다.
6. 5% 기저막 매트릭스(Matrigel)로 코팅된 6웰 배양 플레이트를 준비합니다.
   1. 우물 바닥에 5% 기저막 매트릭스(MESCM[표 1]에 용해됨)를 코팅합니다.

토론

각막 투명도는 일반적으로 각막 기질에 작은 섬유(직경 25-30nm)의 규칙적인 배열과 분포에 의해 유지되며, 이는 정상 시력에 매우 중요하다¹⁶. 전 세계적으로 2억 5,300만 명의 시각 장애인이 있으며, 그 중 3,600만 명이 시각 장애인입니다¹⁷. 세계보건기구(WHO)는 각막 실명을 인간의 시력에 가장 심각한 위험 중 하나로 간주하며, 전 세계 실명의 5.1%를 차지합니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100