Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

요약

이 논문은 편광에 민감한 이광자 현미경을 적용하여 표지가 없는 아밀로이드 상부구조-구형석 내의 국소 조직을 특성화하는 방법을 설명합니다. 또한 샘플을 준비 및 측정하고, 필요한 설정을 조립하고, 데이터를 분석하여 아밀로이드 섬유의 국소 조직에 대한 정보를 얻는 방법을 설명합니다.

초록

1광자에 비해 2광자 여기(excitation)는 광독성이 낮고, 조직 침투가 깊고, 조밀하게 밀집된 시스템에서 효율적으로 작동하고, 형광단의 각도 광선택이 감소하기 때문에 바이오이미징 실험에 유용합니다. 따라서 이광자 형광 현미경(2PFM)에 편광 분석을 도입하면 선형 광학 프로세스를 기반으로 하는 표준 이미징 방법에 비해 샘플의 분자 조직을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 연구에서는 편광에 민감한 2PFM(ps-2PFM)과 복잡한 생체 구조-아밀로이드 구형 입자 내 분자 순서 결정에 대한 응용에 중점을 둡니다. 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환은 종종 손상된 단백질 접힘 과정으로 인해 형성된 아밀로이드 단백질 응집체의 검출을 통해 진단됩니다. 이들의 구조를 탐구하면 생성 경로를 더 잘 이해할 수 있고, 결과적으로 더 민감한 진단 방법을 개발할 수 있습니다. 이 논문은 소 인슐린 구형석 및 구형 아밀로이드 단백질 응집체 내부의 국소 피브릴 순서 측정에 적합한 ps-2PFM을 제시합니다. 또한, 우리는 제안된 기술이 구형석 내부의 피브릴의 3차원 조직을 해결할 수 있음을 증명합니다.

서문

지난 수십 년 동안 단백질과 그 응^집체1의 바이오이미징을 위한 수많은 형광 현미경 기술이 크게 발전했지만, 샘플 ^2,3 내에서 국소 순서를 확인하는 데 사용된 것은 소수에 불과합니다. 형광 수명 이미징 현미경⁴는 아밀로이드 상부 구조-구형석의 고유한 구조적 이질성을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 구형석(spherulites)과 같은 복잡하고 조밀하게 포장된 생물구조 내부의 국소 질서에 대한 정량적 결정은 편광에 민감한 방법을 사용하여 해결할 수 있습니다³. 그러나 UV-VIS 파장을 사용하여 생체 내 형광단을 여기시키면 조직 광 산란이 높기 때문에 표면 조직 침투를 사용하는 표준 형광 기술은 제한적입니다⁵. 또한 이러한 이미징은 종종 특정 형광 프로브를 설계하고 표적 생체 분자에 바인딩해야 하므로 이미징을 수행하는 데 필요한 비용과 작업량이 증가합니다.

최근 이러한 문제를 해결하기 위해 우리 팀은 생물학적 구조의 무표지 이미징을 위해 편광 민감성 이....

프로토콜

1. 완전히 자란 구형석으로 현미경 슬라이드 준비

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 모든 용액은 정수 시스템에서 얻은 탈이온수(25°C에서 18.2MΩ·cm)로 제조되었습니다.

1. Krebs et al¹⁶에 의해 기술된 프로토콜에 따라 아밀로이드 스페룰라이트를 배양합니다. 아래에 설명된 대로 몇 가지 수정이 있습니다.
   1. 1.5mL 튜브에 인슐린 분말 10mg을 넣습니다.
   2. 탈이온화된 H_2O/HCl 용액(pH 1.5)의 1mL 부분 표본으로 분말을 용해시킵니다.
   3. 샘플을 테이프로 밀봉하고 열 믹서에 넣어 70°C(0rpm)에서 24시간 동안 배양합니다.
      참고: 아밀로이드의 네이티브(즉, 수화된) 환경에서 이미징을 수행하고 탈수로 인한 샘플 변형을 방지하려면 다음 설명( 그림 2 참조)에 따라 현미경 슬라이드를 준비해야 합니다.
2. 현미경 유리 슬라이드를 물로 철저히 씻으십시오.
....

토론

편광에 민감한 이광자 현미경은 아밀로이드 상부구조 내부의 원섬유의 국부적 순서를 연구하는 데 유용한 도구로, 표준 다광자 설정을 약간만 수정하면 됩니다. 비선형 광학 현상에서 작동하기 때문에 단광자 여기 형광 현미경 방법에 비해 각도 광선택을 줄이고 축 분해능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 단일 광자 여기 형광 현미경 기술^19,20과 비교할 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5