유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

요약

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

초록

신장 오가노이드는 다양한 접근법을 통해 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 이러한 오가노이드는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 잠재적인 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 글에서는 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 단계별 절차를 제시하며, 이는 PS(Posterior Primitive Streak)에서 시작하여 중간 중배엽(IM)까지 이어집니다. 이 접근법은 동물성 성분이 없는 정의된 배지인 APEL 2 배지에 의존합니다. 4일 동안 고농도의 WNT 작용제(CHIR99021)를 보충한 후 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9)/헤파린과 저농도 CHIR99021를 추가로 3일 동안 보충합니다. 이 과정에서는 성공적인 신장 오가노이드 생성에 매우 중요하기 때문에 iPSC를 시작할 때 최적의 세포 밀도와 CHIR99021 농도를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 낮은 점착 플레이트의 현탁 배양으로, IM이 사구체, 근위 관형 및 원위 관형 구조를 포함하는 네프론 구조로 점진적으로 발전할 수 있도록 하며, 모두 시각적으로 이해할 수 있는 형식으로 제공됩니다. 전반적으로, 이 상세한 프로토콜은 다양한 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 효율적이고 구체적인 기술을 제공하여 성공적이고 일관된 결과를 보장합니다.

서문

신장은 기능 단위에 따라 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 노폐물을 배출하는 네프론은 체액의 구성을 조절할 수 있습니다. 유전적 돌연변이 또는 기타 고위험 요인에 의해 발생하는 만성 신장 질환(CKD^)은 결국 말기 신장 질환(ESKD)으로 진행됩니다^1,2. ESKD는 네프론의 재생 능력이 제한되어 있기 때문인 것으로 보인다. 따라서 신대체 요법이 필요합니다. 인간 iPSC의 유도 분화는 신장 발달을 연구하고, 환자별 질병을 모델링하고, 신독성 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있는 환자별 3D 신장 오가노이드의 체외 생성을 가능하게 합니다 ^3,4.

배아 발달 과정에서 신장은 원시 줄무늬(PS)와 구별되는 중간 중배엽(IM)에서 유래합니다. 고전적인 WNT 신호전달 경로는 FGF(FGF9, FGF20) 및 BMP(JNK를 통한 Bmp7 신호전달)^5,6,7의 조정된 참여로 IM의 추가적인 분화를 ....

프로토콜

본 연구에 사용된 iPSC는 상업적 출처에서 얻은 것입니다. 세포는 시판되는 기저막 매트릭스-코팅 플레이트 상에 mTeSR 배지로 유지하였다( 재료 표 참조). 표 1 은 연구에 사용된 모든 배지 조성물을 포함하고 있다.

1. 분화 및 후방 원시 줄무늬(PS) 유도를 위한 iPSC 도금

1. 멤브레인 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에서 2mL DPBS로 iPSC를 세척합니다. 피펫을 사용하여 DPBS를 흡인합니다.
2. 시중에서 판매되는 세포 분리 용액( 재료 표 참조) 1mL를 추가하여 iPSC를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. iPSC에 mTeSR 1mL를 추가하고 세포가 플라스틱 표면에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
4. 실온(RT)에서 3분 동안 400 x g 에서 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
5. 멤브레인 매트릭스로 코팅된 24웰 또는 6웰 플레이트에 다양한 세포 밀도를 파종하고 10μM Rho 키나아제 억제제(Y-27632)가 보충된 mTeSR로 배양합니다( ....

토론

iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되었으며, 여기에는 기저 배지, 초기 세포 밀도 및 CHIR99021 농도에 대한 약간의 변형이 포함됩니다. 다양한 실험에서 성공적인 신장 오가노이드 생성을 위한 중요한 요소는 중간 중배엽(IM)과 7일째 세포 상태의 초기 분화인 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, 상이한 iPSC 라인은 세포 증식 및 분화 잠재력의 변화를 나타내어 최적의 세포 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304