봉합사 확장 마우스 모델의 뼈 리모델링을 위한 3D 시각화 기법

요약

이 프로토콜은 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 연구하기 위해 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제시합니다.

초록

두개안면 봉합사는 두개안면 뼈를 연결하는 섬유성 관절을 넘어 중요한 역할을 합니다. 그들은 또한 종변 및 안면 뼈 성장을 위한 주요 틈새 시장 역할을 하며, 중간엽 줄기 세포와 골전구 세포를 수용합니다. 대부분의 두개안면골은 막내 골화를 통해 발달하기 때문에 봉합사의 가장자리 영역이 시작 지점 역할을 합니다. 이러한 중요성으로 인해 이러한 봉합사는 스프링 보조 두개골 금고 확장, 빠른 상악 확장 및 상악 연장과 같은 정형외과 치료에서 흥미로운 표적이 되었습니다. 정형외과적 추적력에 따라 봉합사 줄기세포가 빠르게 활성화되어 확장 중 뼈 리모델링을 위한 동적 소스가 됩니다. 그 중요성에도 불구하고 뼈 리모델링 기간 동안의 생리학적 변화는 잘 이해되지 않고 있습니다. 주로 시상 방향의 전통적인 절편 방법은 전체 봉합사에서 발생하는 포괄적인 변화를 포착하지 못합니다. 이 연구는 시상 봉합사 확장을 위한 표준 마우스 모델을 확립했습니다. 봉합사 확장 후 뼈 리모델링 변화를 완전히 시각화하기 위해 PEGASOS 조직 투명화 방법을 전체 마운트 EdU 염색 및 칼슘 킬레이트 이중 라벨링과 결합했습니다. 이를 통해 고도로 증식하는 세포와 확장 후 전체 종골 뼈에 걸쳐 새로운 뼈 형성을 시각화할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제공하여 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 밝힙니다.

서문

두개안면 봉합사는 두개안면골을 연결하고 두개안면골의 성장과 리모델링에 필수적인 역할을 하는 섬유 조직입니다. 봉합사의 구조는 강을 닮았으며, 골형성 전선(osteogenic fronts)으로 알려진 "강둑"에 영양을 공급하고 구축하기 위한 세포 자원의 흐름을 제공하며, 이는 골막내 골형성(intraembranous osteogenesis)을 통해 두개안면골의 형성에 기여한다¹.

두개안면 봉합사에 대한 관심은 두개안면 봉합사의 조기 폐쇄 및 안면 봉합사 기능 장애를 이해하려는 임상적 요구에 의해 주도되었으며, 이는 두개안면 기형과 어린이의 생명을 위협하는 상태로 이어질 수 있습니다. 개복 봉합 절제술은 임상 치료에 일상적으로 사용되지만, 일부 환자에서는 장기 추적 관찰 결과 불완전한 재골화가 재발하는 것으로 나타났다². 확장 스프링이나 내시경 줄무늬 두개골 절제술을 이용한 최소 침습적 개두술은 조직을 폐기하는 것보다 잠재적인 봉합사를 보존하는 더 안전한 방법을 제공할 수 있다³. 마찬가지로, 안면 마스크 및 확장 장치와 같은 정형외과 치료법은 시상 또는 수평 상악 형성 부전을 치....

프로토콜

여기에 설명된 모든 실험 절차는 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원 동물 관리 위원회(SH9H-2023-A616-SB)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 4주 된 C57BL/6 수컷 마우스를 사용했습니다. 사용된 모든 기구는 시술 전에 멸균되었습니다.

1. 봉합사 확장 모델 준비

1. 두 개의 고정 홀더 준비.
   1. 0.014'' 호주 와이어 또는 스테인리스 스틸 와이어( 재료 표 참조)를 사용하여 가벼운 와이어 플라이어로 나선형 루프를 만듭니다. 루프의 직경은 2mm이고 1mm 테일은 양쪽에 예약되어 있습니다(그림 1A).
   2. 수술을 위한 와이어와 홀더를 오토클레이브, 플라즈마 멸균기 또는 적절한 저온 멸균제(예: 글루타르알데히드)로 멸균합니다.
2. 스프링의 준비.
   1. 맞춤형 스테인리스 스틸 스프링을 준비합니다.
      참고: 이 연구에서는 와이어 직경 0.2mm, 외경 1.5mm, 간격 공간 1mm 및 길이 7mm의 압력 스프링을 사용합니다(그림 1B). 각 1mm 스프링 압축은 ....

토론

표준 봉합사 확장 마우스 모델을 적용하여 한 달간의 전체 리모델링 주기 동안 매주 발생하는 규칙적인 형태학적 변화를 관찰했습니다¹⁰. 이 모델은 종변 봉합사를 확장하여 종아리골 리모델링 및 재생을 연구하고 생체 내에서 다양한 봉합사 세포를 연구하는 데 유용합니다. 이러한 연구 결과를 완전히 제시하기 위해서는 염색된 조직의 3차원 시각화가 필요합니다. 따라?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027