인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

요약

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

초록

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

서문

중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다¹. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다². MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 ^2,8,9

프로토콜

1. hiPSC 유지 보수

1. hiPSC의 해동
   1. 액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.
   2. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).
   3. 세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 10⁴ cells/^cm2).
   4. 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO₂ 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.
2. hiPSC의 통과
   1. 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
   2. 700-8....

토론

이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100