Desmodium caudatum 이 위염이 있는 쥐의 위장 호르몬 및 장내 세균총에 미치는 영향

요약

본 프로토콜은 Illumina 기반 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 사용하여 장내 세균총을 분석하는 방법을 설명하고 허브 달인의 효과를 평가하기 위한 프레임워크를 제공합니다.

초록

쥐의 위염 및 장내 세균총에 대한 Desmodium caudatum 의 효과를 예비적으로 탐색하기 위해 고전적인 살리실산나트륨 방법을 사용하여 만성 위염 쥐 모델을 확립했습니다. 18마리의 SPF 쥐를 대조군(C군), 모델군(M군), 치료군(T군)의 세 그룹으로 나눴다. 위벽의 병리학적 절편은 각 그룹의 쥐로부터 채취하였다. 또한, 각 그룹의 쥐 혈청에서 가스트린과 말론디알데히드의 농도는 ELISA에 의해 측정되었습니다. 또한, 위염이 있는 쥐의 장내 세균총에 대한 D. caudatum 의 효과는 Illumina 기반 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용하여 세 그룹의 장내 세균 군집의 상세한 비교를 통해 탐구되었습니다. 그 결과, D. caudatum 달인은 말론디알데히드 함량을 감소시키고 가스트린 함량을 증가시킬 수 있음을 나타냈다. 또한, D. caudatum 달인은 장내 세균총의 다양성과 풍부함을 향상시켜 장내 세균총을 조절하고 회복시킴으로써 위염 치료에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다.

서문

가장 흔한 임상질환 중 하나인 만성 위염(CG)은 위 점막 상피의 만성적이고 지속적인 염증성 변화를 특징으로 하며, 이는 다양한 병원성 인자에 의해 빈번하고 반복적으로 공격받는다¹. CG의 발생률은 소화기내과 외래 진료율의 40-60%를 차지하는 모든 유형의 위장질환 중 1위를 차지한다². 더욱이 발병률은 일반적으로 나이가 들수록 증가하며, 특히 중년 이상의 경우^{더욱 그렇다 3}. 의심할 여지 없이 CG는 사람들의 삶의 질을 크게 떨어뜨리고 새로운 치료제 발견의 필요성을 강조합니다.

수많은 연구에서 CG의 발생과 발달이 가스트린(GAS^)4,5과 같은 위장 호르몬의 분비와 관련이 있다고 보고했습니다. 소화관에서 흔히 볼 수 있는 위장관 펩타이드 호르몬인 GAS는 호산구에서 히스타민의 방출을 촉진하여 세포가 위산을 분비하도록 자극합니다. 또한 위 점막의 영양과 혈액 공급을 개선하여 위 점막과 정수리 세포의 증식을 촉진한다⁶. 따라서 가스트린은 CG의 발달 수준을 평가하는 지표로 활용될 수 있습니다. 또한 반응성 산화물에 의해 유발되는 지질 과산화 산물은 염증 세포를 활성화하여 CG를 유발할 수 있습니다. 지질 과산화 마커인 말론디알데히드(MDA)는 산화 스트레스의 정도를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 지표입니다. 그것은 위 점막의 자유 라디칼 수준을 어느 정도 반영합니다. MDA 수치는 자유 라디칼에 의해 유발된 국소 위 점막의 불포화 지방산의 공격을 나타낼 수 있다 ^7,8.

장내 미생태학은 숙주의 장에 서식하는 수백만 마리의 미생물로 구성되어 숙주의 건강을 유지하고 숙주의 면역을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 높은 풍부함, 다양성 및 안정적인 미생물군 기능을 특징으로 하는 건강한 장내 세균총은 신진대사에 참여하여 병원성 미생물의 침입에 대한 보호 장벽 역할을 합니다. 장내 세균총의 교란은 개인을 급성 및 만성 위장 질환에 더 취약하게 만든다 ^9,10. 최근 몇 년 동안 위장 질환에 대한 미생물군 치료가 빠르게 진행되어 상당한 효능을 입증했다¹¹. 요약하자면, 장내 세균총에 대한 고려는 위장 질환을 이해하고 해결하는 데 매우 중요합니다.

중국 전통 의학의 보고에서 없어서는 안될 구성 요소로서 민간 의약 재료는 임상 실습과 국민 의학의 현대화에 큰 의미를 지닙니다. Desmodium caudatum (Thunb.) DC.는 장기간 Mianyang 시의 Beichuan Qiang 지역에 있는 위 불편 구호를 위해 널리 이용되었습니다. 일부 논문에서는 D. caudatum의 위장 질환 치료에 대한 과학적 근거를 제시하며, 지혈, 항산화 및 위장 보호 등의 효과를 언급하고 있다 12,13,14. 그러나 심도 있는 연구가 부족하여 임상 약력학 메커니즘이 확립되지 않았습니다. 이 논문은 위장 호르몬과 장내 세균총을 기반으로 위염 치료에 대한 D. caudatum의 효과를 연구하고 합리적인 임상 적용의 기초를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

동물의 보살핌과 이용에 관한 절차는 몐양사범대학 윤리위원회의 승인을 받았으며 동물의 윤리적 이용에 관한 모든 관련 제도 및 정부 규정을 엄격히 준수했다. 본 연구에서는 SPF 쥐(쿤밍 종, 수컷과 암컷 모두, 무게 180-220g)를 활용했습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 모든 동물은 병원균이 없는 환경에서 사육되었으며 음식에 대한 자유로운 접근이 제공되었습니다.

1. 시약의 준비

1. 전자 저울로 5g의 살리실산나트륨 분말( 재료 표 참조)의 무게를 측정하여 2.5% 살리실산나트륨 용액을 준비합니다. 분말을 소량의 증류수에 녹이고 총 부피 50mL로 희석합니다.
2. D. caudatum 달인 물(12.8g/kg)을 준비합니다. D. caudatum 128g(재료 표 참조)의 무게를 측정하고 1000mL의 실험실 증류수가 들어 있는 둥근 바닥 플라스크에 넣고 최종 부피 100mL로 농축합니다.

2. 그룹화 및 관리

1. 쥐를 여러 그룹으로 나누고 필요한 용액을 위내로 투여합니다.
   참고: 본 연구에서는 18마리의 쥐(수컷 9마리, 암컷 9마리)를 대조군(C군), 모델군(M군), 치료군(T군)의 3개 그룹으로 나누었으며, 각 그룹에는 6마리의 쥐가 있었다. 대조군에는 식염수를 투여하고, 모델군에는 5% 살리실산나트륨 용액을 10mL/kg/일의 용량으로 5주간 투여하였다¹⁵. 치료군은 10mL/kg/일의 용량으로 5주 동안 5% 살리실산나트륨 용액으로 전처리한 후 10일 동안 1mL/100g의 용량으로 D. caudatum 달인을 투여했습니다^15,16.
2. 실험 마지막 날에 꼬리 운반 방법⁽¹⁷ )을 사용하여 건조하고 멸균된 미세 원심분리기 튜브에서 쥐의 대변을 수집하고 액체 질소 초저온 냉동고에서 동결합니다.
3. 샘플링이 끝난 후 자궁 경부 탈구로 쥐를 희생합니다(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름). 가위로 복강을 열어 복부 대동맥을 노출시킵니다.
   1. 바늘(23-25G)을 복부 대동맥에 거의 평행하게 삽입하고 혈청을 모아 초저온 냉동고에 보관합니다. 복강(¹⁶ )에서 위를 꺼내 보존을 위해 10% 포르말린 용액에 담근다.
      참고: 그룹 M에서, 만성 위염 모델은 위 점막이 확장되고 규칙적인 선형태¹⁵로 울혈되는 경우, 라미나 프로프리아(lamina propria)에서 소량의 염증성 세포 침윤을 관찰하는 경우 성공적인 것으로 간주된다.

3. 위벽의 병리학적 단면

1. 병리학적 절편에 대해 각 그룹의 쥐에서 위벽 샘플을 채취합니다. 그 후, 병리학적 변화를 관찰하고 분석하기 위해 일상적인 헤마톡실린-에오신 염색을 수행한다¹⁸.

4. 혈청 위장 호르몬의 결정

1. 혈청 샘플에서 제조업체의 지침에 따라 ELISA를 사용하여 가스트린(GAS) 및 말론디알데히드(MDA)¹⁹ 의 함량을 검출합니다( 재료 표 참조). 분석을 위해 마이크로플레이트 리더를 활용합니다.

5. 대변 총 DNA 추출 및 PCR 증폭 및 정제

1. 시판되는 DNA 분리 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 미생물 DNA 추출을 수행하고 UV-Vis 분광 광도계¹⁶을 사용하여 농도와 순도를 결정합니다. 그 후, 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 DNA 무결성을 평가한다¹⁸.
2. thermocycler PCR 시스템¹⁷을 사용하여 프라이머 338F(5′-ACT, CCT, ACG, GGA, GGA, GGC, AGC, AG-3′) 및 806R(5′-GAC, TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′)로 박테리아 16S rRNA 유전자를 증폭합니다. 프라이머는 상업적 출처에서 얻습니다( 재료 표 참조).
   참고: PCR 프로그램을 따릅니다: 변성(3분, 95°C), 27주기(30초, 95°C, 30초, 55°C, 45초, 72°C) 및 최종 확장(10분, 72°C). 5× DNA 중합효소 완충액 4μL, 2.5mM dNTP 2μL, 각 프라이머 0.8μL(5μM), DNA 중합효소 0.4μL, 템플릿 DNA 10ng 성분으로 PCR 반응을 수행합니다( 재료 표 참조).
3. PCR 산물을 2% 아가로스 겔, 시판되는 DNA 겔 추출 키트 및 형광계를 각각 사용하여 순차적으로 추출, 정제 및 정량화한다¹⁷.

6. 시퀀싱

알림: 6단계 및 7단계는 이전에 게시된 방법^20,21에 따라 수행됩니다.

1. 염기서열분석을 위해 Illumina 플랫폼을 활용합니다.
   참고: DNA 조각의 한쪽 끝은 칩에 내장된 커넥터의 베이스를 보완하여 칩에 고정합니다. 다른 쪽 끝은 인접한 다른 매립 조인트의 베이스를 무작위로 보완하여 "브리지"를 형성합니다.
2. PCR 증폭을 수행하여 DNA 클러스터를 생성합니다. DNA 증폭기를 단일 가닥으로 선형화합니다.
3. 4개의 뚜렷한 형광 마커를 특징으로 하는 디옥시리보뉴클레오티드 삼인산(dNTP)과 함께 변형된 DNA 중합효소를 도입합니다. 사이클당 하나의 염기만 합성합니다.
4. 레이저를 사용하여 반응 플레이트의 표면을 스캔하고 각 템플릿 염기서열의 초기 반응 중에 중합된 뉴클레오티드 유형을 결정합니다.
5. "형광기"와 "종단기"를 화학적으로 절단하여 3' 끈적끈적한 말단을 재설정합니다. 이어서, 제2 뉴클레오티드를 중합으로 진행한다.
6. 각 라운드에서 수집된 형광 신호 결과를 분석하여 템플릿 DNA 단편의 염기서열을 얻습니다.

7. 염기서열분석 데이터 처리

1. 처음에는 점수가 Q20인 모든 사이트에서 원시 fastq 데이터의 읽기< 트리밍하고 베이스가 불확실한 읽기를 제거합니다. 또한 정확하게 일치하는 프라이머에서 두 개의 불일치를 허용합니다. 이어서, 서열을 겹침 >10 bp와 병합합니다.
2. UPARSE를 사용하여 97% 유사성을 가진 OTU(Operational Taxonomic Unit)를 클러스터링하고 UCHIME^20,21을 사용하여 키메라 시퀀스를 제거합니다.
3. RDP 분류기 알고리즘을 사용하여 70%의 신뢰 임계값을 사용하여 Silva(SSU123) 16S rRNA 데이터베이스에 대해 각 16S rRNA 유전자 서열의 분류를 분석합니다.
4. 알파 다양성 분석과 베타 다양성 분석은 각각 Mothur와 Qiime을 사용하여 수행합니다( 재료 표 참조).

8. 통계 분석

1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 이 연구의 데이터를 분석합니다( 자료표 참조). 여러 그룹 간의 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하고 두 그룹 간의 비교에는 최소 유의차 검정(LSD)을 사용합니다.
2. P < 0.05는 모든 비교에서 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. P < 0.01은 매우 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

위벽의 병리학적 부분의 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 그룹 C와 비교했을 때, 그룹 M은 경미한 위벽 위축과 경미한 염증을 보였다. 그러나 M군과 비교했을 때 T군은 뚜렷한 염증, 장 화생 또는 위축을 보이지 않았습니다. 이는 D. caudatum 달인이 위염을 효과적으로 개선할 수 있음을 시사합니다.

혈청 위장관 호르몬 분석 결과는 그림...

토론

장(趙)나라 민족이 흔히 사용하는 민간요법인 D. 카우다툼(D. caudatum)¹²은 위장병 치료에 상당한 효능을 보였다. 현대 약리학 연구의 발전으로 위장 미세생태학적 불균형으로 인한 세균총의 불균형은 급성 및 만성 위장 질환의 핵심 요인으로 확인되었습니다^22,23. 장관의 특정 미생물은 신체의 동적 균형을 유지하는 데 중요한 역할...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha diversity analysis	Mothur 1.30.2
AxyPrep deoxyribonucleic acid (DNA) gel extraction kit	Axygen Biosciences	AP-GX-50
Beta diversity analysis	Qiime 1.9.1
Cryogenic refrigerator	Forma-86C ULT freezer
Desmodium caudatum	The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County
E.Z.N.A. soil kit	Omega Bio-tek	D5625-01
Illumina MiSeq Platform	Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan Spectrum	spectraMax i3
OTU clustering	Uparse 7.0.1090
OTU statistics	Usearch 7.0
PCR instrument	TransGen AP221-02
PCR instrument	ABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST double-stranded DNA (dsDNA) system	Promega Corp.
Sequence classification annotation	RDP Classifier 2.11
Sodium salicylate	Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd	54-21-7
SPF rats	Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0	IBM