인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

요약

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

초록

인간 배아 줄기(ES) 및 유도 만능 줄기(iPS) 세포는 무제한 증식 및 만능 특성으로 인해 심각하게 병든 장기를 치료하기 위한 세포 기반 재생 의학에 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 그러나 인간 ES/iPS 세포를 100% 순수 표적 세포 유형으로 분화시키는 것은 환경에 대한 민감도가 높기 때문에 어렵습니다. 이식 후 종양 형성은 오염, 증식, 미분화 세포에 의해 발생하므로 재생 의학의 안전한 실현을 위해서는 고순도 기술이 필수적입니다. 종양 형성의 위험을 완화하기 위해 인간 iPS 세포 유래 간세포에 대한 고순도 기술이 개발되었습니다. 이 방법은 유전자 변형 없이 높은 미토콘드리아 함량과 세포 표면 마커 ALCAM(활성 백혈구 세포 접착 분자)의 조합을 사용하여 FACS(형광 활성화 세포 분류)를 사용합니다. 이 방법을 사용하여 정제된 간세포의 97% ± 0.38%(n=5)에서 알부민 단백질 발현을 나타냈다. 이 기사는 인간 iPS 세포를 간세포로 분화하는 가장 최근의 2차원 분화 방법에 적용되는 이 방법에 대한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

서문

배아 및 유도 만능 줄기 세포(각각 ES 및 iPS)는 재생 요법을 위한 유망한 세포 공급원으로 간주됩니다. 그러나, 이러한 세포를 특정 표적 세포 유형으로 분화하는 효율성은 동일한 세포주, 프로토콜 및 실험자 1,2,3,4를 사용하는 경우에도 다를 수 있습니다. 이러한 변동성은 인간 ES/iPS 세포가 환경에 민감하게 반응하기 때문일 수 있습니다. 따라서 현재로서는 순수한 타겟 세포를 지속적으로 획득하기 어렵습니다. 안전성이 높은 재생의학을 달성하기 위해서는 치료세포에서 증식세포와 미분화줄기세포를 제거하는 것이 중요하며, 표적세포에 대한 첨단 정제 기술이 필수적이다 ^5,6,7.

세포 분류기는 개별 세포를 즉시 분석하고 형광 신호 강도를 기반으로 관심 있는 활성 세포를 분류하는 장치로, 유망한 솔루션을 제공합니다. 이는 세포 유형별 표면 마커의 항체 ....

프로토콜

이 연구는 상업적으로 획득한 인간 iPS 세포(253G1 균주)를 사용했습니다( 재료 표 참조).

1. 인간 iPS 세포의 유지

1. 0.25 μg/cm² iMatrix-511로 코팅된 배양 접시의 AK02 배지에서 인간 iPS 세포를 공급이 없는 상태로 유지합니다( 재료 표 참조).

2. 2D 배양에서 인간 iPS 세포의 간 분화

참고: 간 분화의 일일 일정에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오. 공정 전반에 걸쳐 6-웰 배양 플레이트를 사용하고 지정된 세척액 또는 배양 배지 2mL를 각 웰에 추가합니다. 37°C에서 100% 습도, 5%_CO2 및 20%_O2 에서 세포 배양 조건을 유지합니다.

1. 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 기저막 매트릭스(PBS(-)에서 1/25로 희석)를 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
2. 10μM ROCK 억제제(Y-2....

토론

영양소 대사와 해독 작용을 하기 때문에, 간세포는 다른 세포 유형에 비해 상대적으로 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고^{있다 15}. ALCAM은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 세포 접착 및 이동에 중요한 역할을 합니다. 간세포, 상피세포, 림프구세포, 골수세포, 섬유아세포, 신경세포 등 다양한 세포 유형에서 발현된다¹⁶. 미토콘드리아 기반 방법과 ALCAM 항?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159