Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

요약

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

초록

간질은 재발성 발작을 특징으로 하는 신경 장애로, 유전적 기원과 부분적으로 관련이 있으며 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미칩니다. 간질의 임상적 중요성에도 불구하고 중추 신경계의 신경 활동에 대한 기능적 분석은 여전히 개발되어야 합니다. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표의 안정적인 발현과 함께 이미징 기술의 최근 발전은 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석으로 인해 간질의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위한 도구로 등장했습니다. 이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 위한 새롭고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 뇌 전체는 잘 알려진 간질 유전자인 cac로 준비되며, 강타 민감성 발작 유사 행동 분석의 후속 조치로 신경 활동을 식별하기 위해 컨포칼 현미경으로 칼슘 이미징을 위해 녹다운 파리를 만듭니다. cac 넉다운 파리는 야생형 파리보다 더 큰 스파이크와 더 적은 작은 스파이크를 포함하여 발작과 유사한 행동과 비정상적인 칼슘 활동의 비율이 더 높았습니다. 칼슘 활동은 발작과 유사한 행동과 상관관계가 있었다. 이 방법론은 간질에 대한 병원성 유전자를 스크리닝하고 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색하는 데 효율적인 방법론 역할을 합니다.

서문

간질은 자발적이고 이유 없는 발작과 비정상적인 신경 네트워크 활동의 재발을 특징으로 하는 복잡한 만성 신경 장애로, 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미치며 가장 흔한 신경 질환^중 하나이며1 가족과 사회에 큰 부담을 줍니다. 뇌전증의 영향을 고려하여 발작의 원인을 규명하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 그 중 유전학은 많은 유형의 간질 또는 간질 증후군의 주요 원인으로 승인되었다². 지난 수십 년 동안 게놈 기술의 발전으로 인해 이온 채널 및 비이온 채널 유전자를 포함하여 발작 발생에 중요한 역할을 하는 새로운 간질 관련 유전자의 발견이 급격히 증가했습니다 ^3,4. 그러나 유전자와 간질 표현형 사이의 근본적인 메커니즘과 기능 분석은 완전히 이해되지 않았습니다. 뇌전증 관련 유전자 및 기전을 규명하는 것은 환자를 효율적으로 관리할 수 있는 가능성을 제공한다 ^5,6.

세포질 칼슘 신호는 신경 활동과 시냅스 전달의 중추적인 요소입니다. 뇌 ....

프로토콜

1. Bang-sensitive 분석을 위한 프로토콜

1. Gal4/UAS 시스템(²¹)을 통해 tub-Gal4 드라이버 라인과 UAS-cac-RNAi 라인을 교차하여 실험용 파리를 설정합니다. tub-Gal4 라인의 처녀 파리와 UAS-cac-RNAi 라인의 수컷 파리를 수집합니다. 그런 다음 처녀 파리와 수컷 파리를 같은 유리병에 옮겨 새끼를 수확합니다.
   참고: tub-Gal4 드라이버 라인을 사용하면 cac 유전자의 전역 knockdown을 달성할 수 있습니다. UAS-cac-RNAi 라인을 대조군으로 사용합니다.
2. 3-5일 동안 폐색한 후 100%_CO2 (_CO2 마취 장비)를 사용하여 파리를 부드럽게 마취하고 브러시로 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 파리와 UAS-cac-RNAi 파리를 모두 수집합니다. 이 파리는 테스트 1일 전에 깨끗하고 새 식품 바이알로 옮겨 잘 준비되었는지 확인합니다.
3. CO₂를 사용하여 파리를 부드럽게 마취합니다. 마취가 끝나면 4....

토론

칼슘 이온은 화학적 및 전기적 섭동에 대한 다양한 생리학적 및 병태생리학적 반응에서 중추적인 역할을 하는 중요한 두 번째 메신저 역할을 합니다. 또한, 인간 CACNA1A 유전자에 의해 암호화되는 시냅스전 P/Q 채널의 위상 요소는 글루타메이트^30,31,32를 포함한 다양한 신경 전달 물질의 배출을 매개하는 것으로 확인되었?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background