구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하기 위해 마우스 교근의 동결 손상

요약

이 프로토콜의 목표는 구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하는 것입니다. 생쥐 교근과 경골 전방 근육 간의 조직학을 비교한 결과, 동결 손상 후 교근 섬유화가 확인되었습니다. 이 모델은 구강 안면 근육 섬유증의 기저에 있는 메커니즘에 대한 추가 연구를 용이하게 할 것입니다.

초록

구강 안면 근육은 골격근 조직의 하위 집합을 구성하며, 뚜렷한 진화 궤적과 발달 기원을 가지고 있습니다. somite에서 파생 된 사지 근육과 달리, 구강 안면 근육은 분지 아치에서 유래하며 두개 신경 능선에서 독점적으로 기여합니다. 최근 연구에 따르면 구강 안면 근육 그룹에서도 재생이 다르다는 사실이 밝혀졌습니다. 그러나 근본적인 규제 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 현재의 골격근 재생 모델은 주로 사지와 몸통 근육에 초점을 맞추고 있습니다. 이 프로토콜에서는 드라이아이스를 사용하여 마우스 교근과 경골 전방근의 동결 손상을 유도하여 구강 안면 근육 섬유증 모델을 만들었습니다. 근육 위성 세포와 섬유-지방 생성 전구 세포의 시간적 역학은 두 근육 간에 달랐고, 이로 인해 근섬유 재생이 손상되고 과도한 세포외 기질 침착이 발생했습니다. 이 모델의 도움으로 구강 안면 부위의 근육 재생에 대한 심층적인 연구를 수행하여 구강 안면 질환 환자를 위한 치료 접근법을 개발할 수 있습니다.

서문

구강 안면 근육은 저작, 언어, 호흡 및 얼굴 표정과 같은 일상적인 생리 활동에 중요합니다¹. 그러나 선천성 구강안면 기형의 경우 이러한 근육이 위축성 및 섬유화 변화를 일으켜 신체 건강과 사회적 인지를 손상시킨다². 안면 재건 수술이 여전히 1차 치료법이지만, 수술 후 환자의 최대 30-70%가 여전히 근육 손실과 근육 기능 장애를 겪고 있습니다 ^3,4 구강 안면 근육 재생의 실패는 수술만으로는 해결할 수 없는 내인적 요인에 기인합니다.

구강 안면 근육의 출현은 복잡한 척추 동물의 머리와 방이있는 심장 ^5,6을 동반하는 진화 적 참신함입니다. 좀마이트(somite)에서 유래한 사지(limb)와는 달리, 구강안면근(orofacial muscle)은 분지아치(branchial arch)⁷에서 유래한다. 이러한 계통발생학적 및 존재론적 특성은 그들에게 뚜렷한 재생행동을 유발할 수 있다

프로토콜

이 연구의 모든 동물 시술은 쓰촨대학교 중국서부구강학 학교 윤리위원회(WCHSIRB-D-2020-114)에서 검토하고 승인했습니다. 수컷 C57BL/6마리 마우스(5주령)는 습도 조절(53 ± 2%) 및 온도 조절(23 ± 2°C) 시설에서 사육되었으며 12시간 라이트/다크 사이클에 있었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 결빙 부상

1. 마취: 이소플루란에 적신 면봉으로 생쥐를 진정시키고 50mg/kg의 용량으로 틸레타민-졸라제팜을 복강내로 주입합니다. 수술 전후 진통은 1mg/kg의 용량으로 meloxicam의 복강 내 주사로 제공되었습니다. 수의사 연고로 눈을 보호하십시오. 38°C로 유지되는 가열 패드를 전체 절차 동안 수술용 드레이프 아래에 놓아 동물에게 열 지원을 제공했습니다. 마우스를 수술 테이블에 옆으로 눕힌 후 접착 테이프로 고정합니다(그림 1). 눈꺼풀 반사, 바로잡기 반사 및 페달 철회 반사의 손실로 마취의 충분성을 평가합니다.
   알림: 이소플루오란 마취를 할 때는 한 손에는 마우스를, 다른 한 손에는 이소플루오란에 적신 ....

토론

골격근 재생을 연구하기 위한 다양한 부상 모델이 있으며, 여기에는 물리적, 화학적, 외과적 자극의 사용이 포함된다 10,11,12,13,14,15,16. 카디오톡신과 염화바륨은 근육 재생을 시작하는 데 가장 널리 사용되는 두 가지 화학 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China)	1-ml syringe	/
Acetone	Chron Chemicals	Aceton	/
Adhesion microscope slides	Citotest Scientific	188105	/
Animal depilatory	Phygene Scientific	PH1877	/
BSA (bovine serum albumin)	Solarbio Life Sciences	A8010	/
DAPI	Solarbio Life Sciences	C0065	/
Donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Abcam	ab150129	1:200
donkey serum	Solarbio Life Sciences	SL050	/
Dry Ice	Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)	rice-shaped dry ice	/
IFKine Red Donkey anti-rabbit	Abbkine Scientific Company	A24421	1:200
Insulation barrels (big)	Thermos	D600	/
Insulation barrels (small)	Polar Ware	250B	/
Isoflurane	RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China)	R510-22	/
Isopentane	MACKLIN	M813375	/
Laminin	Sigma-Aldrich	L9393	1:1000
Liquid nitrogen	Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)	/	/
M.O.M kit	Vector Laboratories	BMK-2202
Mice	Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China)	5 weeks old	/
mounting medium	Solarbio Life Sciences	S2100	/
Nertral balsam	Solarbio Life Sciences	G8590	/
Pax7	Developmental Studies Hybridoma Bank	Pax7	1:5
Pdgfra	R&D systems	AF1062	1:40
Sirus Red Staining Kit	Solarbio Life Sciences	G1472	/
Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture)	Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China)	/	/
Tissue-tek OCT	Sakura	4583	/
Triton	Shanghai Scigrace Biotech	ABIO-Biofroxx-0006A	/
Zoletil	Virbac	Zoletil 50	/