인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 최적 단계에서 동결 보존

요약

이 연구는 인간 줄기세포 유래 망막 색소 상피 세포의 효율적인 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 유래한 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 퇴행성 질환이 있는 개인의 세포 교체 요법을 위한 우수한 세포 공급원입니다. 그러나 이러한 치료 세포의 안정적이고 안전한 뱅킹에 대한 연구는 드뭅니다. 동결 보존 후 RPE 세포의 매우 가변적인 세포 생존율과 기능적 회복은 가장 일반적으로 발생하는 문제입니다. 본 프로토콜에서는 원래의 실험 조건을 기반으로 최적의 동결 세포상을 선정하여 해동 후 최고의 세포 회수율을 달성하는 것을 목표로 했습니다. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine 라벨링 분석을 사용하여 결정된 지수 단계에서 세포를 동결하여 해동 후 세포 생존율과 회수율을 개선했습니다. 안정적이고 기능적인 세포는 긴 분화 과정과 무관하게 해동 직후에 얻어졌습니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 hESC 유래 RPE 세포의 간단하고 효율적이며 저렴한 보존 및 해동이 가능합니다. 이 프로토콜은 RPE 셀에 초점을 맞추지만, 이 동결 전략은 다른 많은 유형의 분화된 셀에 적용될 수 있습니다.

서문

망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)는 망막의 적절한 기능을 유지하는 데 필요한 세포의 색소 단층이다¹. RPE 기능 장애 및 사망은 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 Stargardt 질병을 포함한 많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다 ^2,3. RPE 대체 요법은 이러한 질병에 대한 가장 유망한 치료 요법 중 하나입니다 4,5,6,7. 공여체 RPE 세포의 안정적인 공급은 세포 치료에 필수적입니다. 인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래 RPE 세포는 일차 RPE 세포의 기능을 모방하고 이론적으로 무제한으로 공급할 수 있기 때문에 세포 치료에 이상적인 세포 공급원입니다⁸. 그러나 분화 과정은 힘들고 얻어진 RPE 세포의 저장 수명은 후속 상피-중간엽 전이(EMT)로 인해 상대적으로 짧습니다. 따라서 hESC 유래 RPE 세포....

프로토콜

1. 세포 해리

1. 앞서 설명한 대로 RPE 셀을 유지^17,22.
   참고: 모든 세포는 프로토콜 기간 동안 37% CO₅ 분위기에서 2°C에서 성장합니다.
2. 필요한 양의 PBS 및 배양 배지를 37 ° C 수조에서 준비하고 세포 해리 시약을 실온에 둡니다.
3. 배양 용액을 버리고 웰당 1mL의 예열된 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.
4. 세포 해리 시약 1mL를 6-웰 플레이트에 추가하고 37°C에서 15분 동안 세포를 분해합니다. 배양 후 수축하고 가장자리에서 빛나는 세포를 현미경으로 관찰하여 소화가 끝났는지 확인합니다.
   참고: 트립신 기반 해리는 세포 생존율이 낮기 때문에 권장되지 않습니다.
5. 1mL 피펫으로 10배 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 해리하고 세포 현탁액을 예열된 배양 배지(Y-27632 제외)로 1:10의 비율로 희석합니다. 그런 다음 실온에서 250× g에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.
6. 원심분리 후 상층액을 빠르게 붓고, 배양 배지 2mL에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하고, 피펫으로 세포....

결과

여기서, P1D35에서의 hESC-유래 RPE 세포는 10⁵/^cm2의 밀도로 통과되고 파종되었다. 파종 후 일주일 이내에 특징적인 육각형 형태와 색소 침착이 지연 단계 (약 2 일) 동안 손실되었습니다. RPE 세포는 지수 단계(약 5일, 그림 1A)에서 육각형 형태를 점차적으로 다시 채택하고 보다 다각형 형태로 감속 단계(약 6일)에 진입했습니다. 세포 배양을 일주일 더 계속하면 세?.......

토론

본 연구에서는 연구 및 임상적 필요를 위한 hESC 유래 RPE 세포에 대한 성공적인 동결-해동 프로토콜에 대해 설명합니다. 불멸화된 RPE 세포주인 ARPE-19와 달리, 줄기세포 유래 RPE 세포와 같이 적절한 특징적인 상피 표현형 및 기능을 가진 RPE 세포는 동결 보존에 더 민감합니다. 세포의 32% 미만이 제대로 보존되지 않은 경우 해동 후 24시간 동안 남아 있었다¹⁷. 냉동 보존 시기는 중요한.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049