Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드

요약

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

초록

수정체 상피세포(LEC)는 수정체의 항상성과 정상적인 기능을 유지하는 데 여러 가지 중요한 역할을 합니다. LEC는 렌즈의 성장, 발달, 크기 및 투명도를 결정합니다. 반대로, LEC의 기능 장애는 백내장 형성 및 후낭 혼탁(PCO)으로 이어질 수 있습니다. 따라서 강력한 1차 LEC 배양 시스템을 구축하는 것은 수정체 개발, 생화학, 백내장 치료제 및 PCO 예방에 종사하는 연구자에게 중요합니다. 그러나 1차 LEC를 배양하는 것은 제한된 가용성, 느린 증식 속도 및 섬세한 특성으로 인해 오랫동안 어려움을 겪어 왔습니다.

이 연구는 1차 LEC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시함으로써 이러한 장애물을 해결합니다. 이 프로토콜은 최적화된 배양 배지의 제형화, 렌즈 캡슐의 정확한 분리, 트립신화 기술, 하위 배양 절차, 수확 프로토콜, 보관 및 배송 지침과 같은 필수 단계를 포함합니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 모니터링했습니다.

배양된 LEC의 진위를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 중요한 수정체 단백질, 즉 αA- 및 γ-결정체의 존재 및 세포 내 분포를 검출했습니다. 이 상세한 프로토콜은 연구자들에게 일차 LEC를 배양하고 특성화하는 데 유용한 자원을 제공하여 수정체 생물학에 대한 이해와 수정체 관련 질환에 대한 치료 전략 개발을 가능하게 합니다.

서문

눈의 수정체는 들어오는 빛을 망막에 집중시킴으로써 시력에 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 특수 세포로 구성된 투명한 무혈 구조로 구성되어 있으며, 그 중 수정체 상피 세포(LEC)가 핵심 역할을 합니다. LEC는 수정체의 전면에 위치하며 수정체의 투명성을 유지하고, 수분 균형을 조절하며, 수정체의 성장과 발달에 관여하는 역할을 합니다 ^1,2. LEC는 수정체의 앞쪽에 위치한 독특한 유형의 세포로, 평생 동안 수정체 섬유를 지속적으로 생산하여 수정체의 선명도와 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

백내장은 수정체가 점진적으로 흐려져 빛의 왜곡과 산란을 일으켜 시력을 손상시키는 것이 특징입니다 ^3,4. 백내장 형성의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 복잡하고 다인자적이며, 자외선, 산화 손상 및 당화와 같은 다양한 세포 및 분자 과정을 포함합니다 ^5,6. LEC는 백내장의 발병에 크게 기여하는 것으로 밝혀져 연구의 중요한 초점이 되....

프로토콜

모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 지침에 따라 수행되었습니다. 절차적 승인은 University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: IACUC-2022-0008)에서 부여했습니다. 일반적으로 생후 2주 미만의 어린 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.

1. 배양액 준비 및 수정체 해부

1. 50mL의 소 태아 혈청(FBS)과 0.1mL의 겐타마이신 50mg/mL를 DMEM 450mL에 첨가하여 배양 배지를 준비합니다.
2. 2주 미만의 C57BL/6J 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.
   참고:_CO2 흡입 방법을 사용하여 안락사시켰습니다. CO₂ 안락사 시스템의 최적 유속은 챔버 또는 케이지 부피/분의 30%에서 70%를 변위시켜야 합니다.
3. 수술용 가위로 눈꺼풀을 부드럽게 제거하고 눈구멍의 반대쪽에 구부러진 핀셋으로 섬세한 압력을 가하여 눈이 바깥쪽으로 튀어나오도록 합니다. 백내장 칼을 사용하여 각막을 조심스럽게 절개하고 구부러진 핀셋을 사용하여 수정체를 조심스럽게 ....

토론

이 백서에 제시된 프로토콜은 기본 LEC의 성공적인 격리, 배양 및 하위 배양에 대한 포괄적인 단계별 가이드를 제공하며 함께 제공되는 비디오 문서도 함께 제공됩니다. 서면 지침과 함께 상세한 시각적 가이드는 프로토콜의 명확성과 접근성을 향상시켜 해당 분야의 연구자들 사이에서 프로토콜의 사용과 재현성을 촉진합니다. 궁극적인 목표는 백내장 형성 및 백내장 수술 후 만연한 합병증인 PCO?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation