마우스 척수 미세아교세포(Mouse Spinal Cord Microglia)의 빠르고 효율적인 농축

요약

미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.

초록

척추는 척추동물을 정의하고 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관을 형성합니다. 포유류 중추신경계의 적절한 발달과 기능은 미세아교세포(microglia)로 알려진 상주 대식세포의 활동에 크게 의존합니다. 미세아교세포는 이질성과 다기능성을 나타내어 척수와 뇌 내에서 뚜렷한 유전자 발현과 행동을 가능하게 합니다. 수많은 연구에서 대뇌 미세아교세포의 기능을 탐구하여 정화 방법을 광범위하게 설명했습니다. 그러나 생쥐의 척수에서 미세아교세포를 정제하는 것은 포괄적인 설명이 부족합니다. 대조적으로, 정제되지 않은 추출물과 달리 고도로 정제된 콜라겐분해효소의 활용은 중추 신경계 조직 내에서보고가 부족합니다. 이 연구에서는 8-10주 된 C57BL/6 마우스에서 척추와 척수를 절제했습니다. 후속 분해는 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용했고, 미세아교세포 정제는 밀도 구배를 이용했습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 염색을 거쳐 CD11b 및 CD45 염색을 통해 생존율과 순도를 평가했습니다. 그 결과 평균 생존율은 80%, 평균 순도는 95%였습니다. 결론적으로, 마우스 미세아교세포의 조작은 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용한 분해와 밀도 구배를 수반했습니다. 이 접근법은 상당한 척수 미세아교세포 개체군을 효과적으로 생산했습니다.

서문

척추 동물의 특징은 척추 기둥 또는 척추이며, 척추 뼈는 척추 디스크로 나뉘어 진 척추 뼈라고 불리는 일련의 분절 된 뼈로 대체되었습니다. 이러한 골성 물질의 연속은 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관(spinal canal)을 형성한다¹. Rodentia 속의 척추는 일반적으로 7 개의 경추, 13 개의 흉추, 6 개의 요추 및 다양한 수의 꼬리 척추 ^2,3에 의해 형성됩니다. 척수의 길이는 척추의 길이와 비슷하며, 말단 종사는 척수를 천골에 고정하는 비신경 구조입니다. 또한, 신경 섬유는 추간공(intervertebral foramen)^을 통해 빠져나간다 1.

포유류에서 중추신경계의 발달과 적절한 기능은 미세아교세포(microglia⁴)라고 불리는 신경계의 상주 대식세포의 활동에 결정적으로 의존한다. 미세아교세포는 처음에 뇌 상주 식세포로 기술되었지만, 최근 연구는 이러한 세포에 많은 동적 기능을 부여했습니다 ^5,6

프로토콜

이 연구는 공식 멕시코 표준 NOM-062-ZOO-1999 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 대한 승인은 멕시코 아동 병원의 연구, 윤리 및 생물 안전 위원회(HIM/2023/006)와 멕시코 종합 병원 에두아르도 리체아가의 연구 및 생명 윤리 위원회(DI/21/501/04/62)로부터 획득되었습니다. 생후 6주에서 8주령의 C57BL/6 마우스 3마리를 멕시코 아동 병원에서 입수하여 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 환기 랙에서 격리된 조건에서 사육했습니다.

1. 재료 및 시약의 준비

1. Ca 2+ 및 Mg²⁺가 없는 PBS와 Hank의 균형 소금 용액(HBSS)을 37°C로 예열합니다.
2. HBSS 용액에 리베라아제 100μg/mL와 DNase(HBSS-LD) 4μg/mL를 보충합니다. 용액이 7.4의 생리학적 pH를 유지하는지 확인하십시오.
   참고: 척수당 1mL의 작업 용액이 필요합니다.
3. 밀도 구배 원심분리를 위한 등장성 90% 용액(상업적으로 이용 가능, 재료 표 참조)을 준비하고 37°C로 예열합니다.
4. 5% 열 비활성화 소 ....

토론

뇌 항상성에서의 중요성 때문에 미세아교세포 연구를 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 방법에서, 미세아교세포는 전형적으로 배아 또는 신생아 쥐 및 마우스의 대뇌 반구에서 공급된다¹⁷. 제한된 수의 연구가 성체 마우스의 척수에서 미세아교세포의 정제를 다루었다^13,14. 이러한 기술에는 DNAse와 함께 콜라겐분해효소 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining