공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

요약

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

초록

여성 불임의 원인을 이해하는 데 있어 가장 큰 어려움은 난모세포라고 하는 여성 생식세포의 발달을 관장하는 메커니즘을 밝히는 것입니다. 난모세포의 발달은 세포 성장과 후속 분열로 특징지어지며, 난모세포가 정자와 융합하여 배아 발생을 시작할 수 있도록 준비하는 두 가지 중요한 단계입니다. 성장하는 동안 난모세포는 세포질을 재조직하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 생쥐와 인간의 성공적인 난모세포 발달을 예측하여 배아 생성 가능성을 예측하는 사건입니다. 쥐 난모세포에서 이러한 세포질 재편성은 세포골격에 의해 주도되는 것으로 나타났으며, 세포골격의 활동은 핵을 교반하고, 재배치하고, 관통하는 기계적 힘을 생성합니다. 결과적으로, 이 세포질에서 핵질로의 힘 전달은 생체 분자 응축물로 알려진 핵 RNA 처리 소기관의 역학을 조정합니다. 이 프로토콜은 높은 시간적 해상도로 생쥐 난모세포의 공간 규모에 걸쳐 세포골격이 핵에 미치는 영향을 문서화할 수 있는 실험적 프레임워크를 제공합니다. i) 난모세포 세포질의 세포골격 활성, ii) 난모세포핵의 세포골격 기반 교반, iii) 난모세포 핵의 생체 분자 응축물 역학에 미치는 영향을 평가하는 데 필요한 이미징 및 이미지 분석 단계와 도구를 자세히 설명합니다. 난모세포 생물학 외에도, 여기에 설명된 방법은 체세포에서 사용하여 규모 전반에 걸쳐 핵 역학의 세포골격 기반 조정을 유사하게 해결할 수 있습니다.

서문

핵 포지셔닝은 여러 세포 및 발달 기능에 필수적이다 ^1,2,3,4,5. 난모세포(oocyte)라고 불리는 포유류 암컷 생식세포는 크기가 비대칭적으로 분할됨에도 불구하고 세포질을 리모델링하여 세포중심에 핵을 위치시키는데, 이는 후속 염색체의 중심에서 벗어난 염색체에 의존합니다⁶(그림 1). 이러한 핵의 중심화는 생쥐와 인간에서 성공적인 난모세포 발달을 예측하며, ^7,8 따라서 배아 형성 잠재력을 예측합니다(그림 1).

마우스 난모세포의 세포질 리모델링은 주로 악토미오신 세포골격(actomyosin cytoskeleton)⁹에 의해 주도됩니다(

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 공동체의 지침에 따라 수행되었으며 프랑스 농무부(승인 번호 75-1170)와 DGRI(Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation; GMO 계약 번호 DUO-5291). 마우스는 주변 온도가 22-24°C이고 습도가 40%-50%인 12시간 명/어둠 주기로 동물 시설에 수용되었습니다. 여기에 사용된 마우스는 암컷 OF1(Oncins France 1, 8 내지 12주령) 및 암컷 C57BL/6(10 내지 14주령)을 포함한다.

1. 난모세포 채취 및 준비

1. ¹⁸ 및¹⁹에 기술된 바와 같이 8주에서 14주령 마우스의 난모세포를 수집합니다.
   1. 간단히 말해서, 먼저 난모세포에서 감수분열 재개를 방지하는 1μM 밀리논¹⁹가 보충된 예열된(37°C) M2+소 혈청 알부민(BSA) 배지에¹⁸에서와 같이 생쥐에서 난소를 추출합니다.
   2. 수술용 바늘로 난포를 찔러 난포에서 성장하는 난모세포를 방출합니다(난모세포 성장 종료

토론

이 프로토콜의 주요 단계에는 생존 또는 정상 기능에 영향을 미치지 않는 난모세포의 적절한 미세주입(^9,10,11)과 핵 반점과 같은 관련 구조의 정확한 시각화를 가능하게 하는 사전 정의된 양의 cRNA를 미세주입하는 것이 포함됩니다.

세포질과 (내)핵 역학 사이의 연관성을 확립하는 것은 세포골격이 핵 또는 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows