갈색 지방 조직에서 생체 내 대사산물 교환을 측정하기 위한 동정맥 대사체학

요약

이 프로토콜에서는 마우스 모델에서 GC-MS를 사용하는 BAT에 최적화된 동정맥 대사체학과 관련된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법을 통해 유기체 수준에서 BAT 매개 대사 산물 교환에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

초록

갈색 지방 조직(BAT)은 비떨림 열발생으로 알려진 독특한 에너지 소비 과정을 통해 대사 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이를 위해 BAT는 높은 신진대사 수요를 지원하기 위해 다양한 순환 영양소 메뉴를 활용합니다. 또한 BAT는 대사 연료 또는 신호 분자 역할을 할 수 있는 대사 산물 유래 생체 활성 인자를 분비하여 BAT에 의해 매개 조직 내 및/또는 조직 간 통신을 촉진합니다. 이는 BAT가 전신 대사 산물 교환에 적극적으로 참여한다는 것을 시사하며, 이는 이제 연구되기 시작한 흥미로운 특징입니다. 여기에서는 생체 내 마우스 수준에 최적화된 BAT 동정맥 대사체학을 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 견갑간 BAT 유래 정맥혈과 전신 동맥혈을 선택적으로 배출하는 Sulzer 정맥을 사용하는 동정맥 혈액 샘플링 기술과 열발생 자극을 위한 관련 방법에 중점을 둡니다. 다음으로, 이러한 혈액 샘플을 사용하는 가스 크로마토그래피 기반 대사체학 프로토콜을 시연합니다. 이 기법을 사용하면 BAT에 의한 대사 산물의 순 흡수 및 방출을 측정하여 장기 간 수준에서 BAT 조절 대사 산물 교환에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

서문

갈색 지방 조직(BAT)은 미토콘드리아 분리 단백질 1(UCP1) 의존성 및 UCP1 독립적 메커니즘 1,2,3,4,5를 모두 포함하는 비떨림 열발생(NST)으로 알려진 고유한 에너지 소비 특성을 가지고 있습니다. 이러한 특징은 BAT가 전신 대사 조절과 비만, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 및 암 악액질을 포함한 대사 질환의 발병기전을 암시합니다 ^6,7,8. 최근의 후향적 연구는 BAT 질량 및/또는 그 대사 활동과 인간의 비만, 고혈당증 및 심장 대사 건강 사이의 반비례 관계를 보여주었습니다 ^9,10,11.

프로토콜

모든 실험은 성균관대학교 동물보호이용위원회(IACUC)의 승인을 받아 진행되었다. 마우스는 매일 12시간의 빛/어둠 주기에 따라 22°C 및 45% 습도로 설정된 클린룸에 위치한 IACUC 승인 동물 시설에 수용되었습니다. 그들은 환기가 잘 되는 선반에 보관되었고 표준 차우 다이어트 광고(탄수화물 60%, 단백질 16%, 지방 3%로 구성)를 이용할 수 있었습니다. 침구와 둥지 재료는 매주 교체되었습니다. 이 연구를 위해 12주 된 25g에서 30g 사이의 체중이 나가는 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 이 동물들은 상업 공급 업체로부터 공급되었습니다 ( 재료 표 참조).

1. 온도 순응과 약리학적인 자극을 통한 갈색 지방이 많은 조직의 변화 활동의 조절

참고: 며칠에서 몇 주에 걸친 온도 적응 또는 β-아드레날린 수용체 작용제를 사용한 약리학적 자극은 BAT 활성을 조절하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다¹. 따라서 독자가 필요에 따라 적절한 접근 방식을 선택할 수 있도록 방법에 대한 간략한 개요가 아래에 제공됩니다. 대사적으로 비활성(열발생이 적은) BAT를 얻기 위해 C57....

토론

전신 에너지 균형에서 BAT의 대사 잠재력을 이해하는 데 중요한 단계는 BAT가 소비하는 영양소, 대사 처리 방법, 순환계로 방출되는 대사 산물을 정의하는 것입니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 마우스에서 견갑간 BAT의 정맥 혈관 및 전신 동맥 혈관에 접근할 수 있는 특수 동정맥 샘플링 기술을 도입하며, 이는 최근 Park et^{al 42}에 의해 개발 및 검증되었습니다. 다음은 프로토콜을 따를 때 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C