인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

요약

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

초록

호중구는 선천성 면역 체계의 중요한 부분을 형성하는 골수성 계통 세포입니다. 지난 10년 동안 호중구는 항균 방어에 중요한 구조인 호중구 세포외 트랩(NET)의 형성을 포함한 여러 메커니즘을 통해 면역 조절 장애의 시작 및 영속에 기여함으로써 암, 자가면역 질환 및 다양한 급성 및 만성 염증 상태의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 편향되지 않고 재현 가능하며 효율적인 방식으로 NET 형성을 정량화하는 기술의 한계로 인해 건강과 질병에서 호중구의 역할을 더 깊이 이해할 수 있는 능력이 제한되었습니다. 세포 내 및 세포 외 DNA를 이미지화하기 위해 두 가지 다른 DNA 염료를 사용하는 막 투과성 의존적 이중 염료 접근 방식과 결합된 살아있는 세포 이미징 플랫폼을 사용하여 NET 형성을 진행 중인 호중구를 정량화하는 자동화된 실시간 고처리량 방법을 설명합니다. 이 방법론은 호중구 생리학을 평가하고 NET 형성을 표적으로 할 수 있는 분자를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 염증 자극에 반응하여 호중구에서 압출된 거미줄 모양의 염색질 구조입니다. NET은 DNA, 히스톤 및 다양한 항균 단백질/펩타이드로 구성되어 감염성 병원체를 포획하여 죽이고 염증 반응을 유발합니다¹.

NET은 병원균에 대한 숙주 방어에 도움이 되지만, 다양한 자가면역질환², 혈전증³, 대사질환⁴, 암5의 전이성 성장의 잠재적 동인으로 주목^{받고 있다.} 따라서 NET 형성 억제는 이러한 질병에 대한 잠재적인 치료 옵션입니다. 그러나, 개발⁶에서 일부 유망한 NETs-표적 분자에도 불구하고, 이 메커니즘에 특이적으로 영향을 미치는 승인된 치료법은 아직 없다. 이는 적어도 부분적으로는 NET 형성을 위한 객관적이고, 편향되지 않고, 재현 가능하고, 처리량이 많은 정량화 방법이 부족하기 때문입니다.

우리는 이중 색상 라이브 셀 이미징 플랫폼 ^7,8

프로토콜

건강한 인간 피험자의 호중구는 미국 국립보건원(NIH)의 임상시험계획위원회(IRB) 승인 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의가 제공된 후 획득되었습니다. 이 프로토콜은 NIH 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 호중구의 염색 및 분석판의 준비

1. 각 기관의 지침에 따라 적절한 서면 동의서와 함께 말초 혈액을 채취하고 원하는 방법을 사용하여 호중구를 분리합니다. 예를 들어, 피콜-덱스트란 방법(^10,11)은 인간 말초 혈액으로부터 호중구를 분리하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이다.
   참고: 여기서 논의된 방법은 인간 호중구를 사용하지만 마우스 호중구도 유사한 프로토콜을 사용하여 분석할 수 있습니다.
2. Roswell Park Memorial Institute(RPMI, 재료 표 참조) 1640 배지에서 2.0 x 10⁶ 호중구/mL로 호중구를 재현탁시키고 호중구 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
   참고: FBS의 알부민은 NET 형성¹² 을 감소시킬 수 있고....

토론

NET을 생체 외(ex vivo)로 정량화하는 현재의 방법에는 호중구, NET 및 잠재적 치료 표적을 편향되지 않은 고처리량 방식으로 연구하는 능력을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다^10,14. 예를 들어, NET의 정량화를 위한 황금 표준으로 간주되는 면역형광 염색 후 NET-형성 세포의 직접 계수는 처리량이 낮고 작업자의 주관적인 관점에 따라 달라집니다. 막?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.