암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

요약

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

초록

암 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 암 세포주와 비교하여 인간 질병을 더 잘 재현하는 다기능 연구 시스템입니다. PDO 모델은 세포외 기저막 추출물(BME)에서 환자 종양 세포를 배양하고 3차원 돔으로 도금하여 생성할 수 있습니다. 그러나 단층 배양에서 표현형 분석에 최적화된 시판되는 시약은 BME와 호환되지 않는 경우가 많습니다. 여기에서는 자동화된 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 PDO 모델을 도금하고 약물 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 또한 kinetic 측정과 호환되는 형광 염료를 적용하여 세포 건강과 세포 사멸을 동시에 정량화합니다. 이미지 캡처는 며칠에 걸쳐 일정한 시간 간격으로 발생하도록 사용자 지정할 수 있습니다. 사용자는 개별 Z 평면 이미지 또는 여러 초점면의 연속 이미지의 Z 프로젝션에서 약물 효과를 분석할 수 있습니다. 마스킹을 사용하여 PDO 번호, 면적 및 형광 강도와 같은 특정 관심 파라미터를 계산합니다. 당사는 세포 독성 물질이 세포 건강, 세포 사멸 및 생존력에 미치는 영향을 입증하는 개념 증명 데이터를 제공합니다. 이 자동화된 키네틱 이미징 플랫폼은 암의 PDO 모델에서 다양한 치료 효과를 이해하기 위해 다른 표현형 판독으로 확장될 수 있습니다.

서문

환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 암 발생 및 치료 반응을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 빠르게 부상하고 있습니다. PDO는 원발성 종양 ^1,2의 복잡한 게놈 프로필과 구조를 재현하는 3차원(3D) 세포 배양 시스템입니다. 불멸화된 암 세포주의 전통적인 2차원(2D) 배양과 달리, PDO는 종양 내 이질성 ^3,4을 포착하고 유지하므로 기계론적 연구와 중개 연구 모두에 유용한 도구입니다. PDO가 점점 더 대중화된 모델 시스템이 되고 있지만, PDO 배양과 호환되는 세포 효과에 대한 상업적으로 이용 가능한 시약 및 분석 방법은 제한적입니다.

치료 반응의 미묘한 변화를 분석할 수 있는 강력한 방법이 없기 때문에 임상 번역이 방해를 받습니다. 3D 배양에서 최고의 세포 건강 시약인 CellTiter-Glo 3D는 ATP 수준을 세포 생존율의 결정 요인으로 활용합니다 ^5,6. 이 시약은 종말점 분석에 유용하지만 몇 가지 주의 사....

프로토콜

인간 종양 표본을 사용한 연구는 아이오와 대학교 IRB(Institutional Review Board), 프로토콜 #201809807의 검토 및 승인을 받았으며 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 포함 기준에는 암 진단과 종양 표본의 가용성이 포함됩니다.

1. 96웰 플레이트에 온전한 PDO 도금

1. 시약을 준비합니다.
   1. 96웰 플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 BME를 4°C에서 밤새 해동합니다.
   2. 관심 있는 암 유형 배양에 최적화된 전체 오가노이드 배양 배지를 준비합니다. 본원에 제시된 실험에 사용되는 특정 배양 배지는 보충 표 1에 나와 있다.
      참고: 종양 유형에 따라 미디어 구성 요소를 수정해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 오가노이드 배양 배지는 부인과 종양에 대해 100nM 에스트라디올로 보충된다¹³. 준비된 배지는 4°C에서 1개월 동안 안정적입니다. 장기 보관을 위해 배지를 50mL 튜브에 분주하고 -20°C에서 보관합니다.

토론

PDO 배양은 세포 반응과 거동을 반영할 수 있는 능력으로 인해 체외 모델 시스템에서 점점 더 인기를 얻고 있다². PDO 생성, 배양 및 확장 기술에서 상당한 발전이 이루어졌지만 치료 반응을 분석하는 방법은 뒤처져 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 3D 생존도 키트는 용해 종말점 분석으로, 잠재적으로 가치 있는 역학 반응 데이터를 놓치고 다른 방법에 의한 후속 분석을 제한한다.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)