In vitro 모델링을 위한 Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells의 분리

요약

이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.

초록

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체를 지지하는 역할을 하는 외막 외막의 중요한 단층입니다. RPE 변성은 일반적으로 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 점진적인 시력 상실을 특징으로 하는 질병에서 발생합니다. AMD에 대한 연구는 RPE를 나타내기 위해 인간 기증자의 눈 또는 유도만능줄기세포(iPSC)에 의존하는 경우가 많습니다. 그러나 이러한 RPE 소스는 배양을 위해 연장된 분화 기간과 상당한 전문 지식이 필요합니다. 또한 일부 연구 기관, 특히 농촌 지역의 연구 기관은 기증자의 눈에 쉽게 접근할 수 없습니다. 상업적으로 이용 가능한 불멸의 RPE 세포주(ARPE-19)가 존재하지만, 생체 내 필수 RPE 기능이 부족하고 많은 안과 연구 간행물에서 널리 받아들여지지 않습니다. 보다 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적인 소스에서 대표적인 1차 RPE 세포를 확보해야 할 필요성이 시급합니다. 이 프로토콜은 돼지 눈에서 사후 검시한 1차 RPE 세포의 분리 및 하위 배양을 설명하며, 이는 상업 또는 학술 공급업체로부터 현지에서 공급받을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조직 배양 실험실에서 일반적으로 볼 수 있는 일반적인 재료가 필요합니다. 그 결과 iPSC, 인간 기증자 눈 및 ARPE-19 세포에 대한 1차적이고 차별화된 비용 효율적인 대안이 탄생했습니다.

서문

망막 색소 상피(RPE)는 브루흐 막과 광수용체 사이의 외막 망막에 위치한 단층이다¹. RPE 세포는 zonula occludens-1 (ZO-1)과 같은 단백질과 긴밀한 연접을 형성하고 색소 침착 및 육각형 형태 ^2,3을 특징으로하는 독특한 표현형을 가지고 있습니다. 이 세포는 혈액-망막 장벽에 기여하여 광수용체 건강을 지원하고 망막 항상성을 유지합니다 ^4,5. 또한 RPE 세포는 빛을 흡수하고 광수용체의 필수 구성 요소를 재활용함으로써 시력에 중요한 역할을 합니다⁶. 예를 들어, RPE 세포에서 고도로 발현되는 단백질인 RPE65는 all-trans 레티닐 에스테르를 11-시스 레티놀 ^7,8로 전환합니다. RPE 세포가 수행하는 다양한 기능을 감안할 때, RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막병증을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다^....

프로토콜

이 절차에 사용된 눈은 USDA가 검사한 현지 정육점에서 사후 검시한 것이며 살아있는 동물을 사용하여 작업을 수행하지 않습니다. 동물을 희생 제물로 바친 후 약 2시간이 지나야 눈이 적출됩니다. 조직 부패가 발생하기 시작할 수 있으므로 더 이상의 충치를 방지하기 위해 이송 중에 눈을 시원하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에서 눈은 적출 후 즉시 냉장고에 넣습니다. 그 후, 눈 주머니는 1000mL 폴리프로필렌 비커 안에 배치되고 8L 쿨러 내에서 얼음으로 둘러싸여 있습니다. 얼음에 직접 눈을 대지 않는 것이 중요합니다. 눈이 실험실에 도착하면 RPE 세포의 분리는 생물 안전 캐비닛 내에서 수행됩니다. 3-5시간 이내에 이 프로세스를 완료하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 10개의 눈을 처리하는 데 최적화되어 있습니다.

1. DNase 원료 부분 표본 준비

알림: 이 단계는 격리 전에 수행하는 것이 좋습니다.

1. 멸균 탈이온수로 5mM 염화칼슘 용액을 준비합니다.
   주의 : 염화칼슘 분말은 눈에 심한 자극이나 손상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 PPE를 착용하십시오.
2. 5mM 염화칼슘 용액을 DNase 분말( ....

토론

이 프로토콜은 돼지 눈에서 RPE 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 색소 침착 및 조약돌 형태는 분리 후 7일 이내에 관찰됩니다(그림 1B). 더욱이, TEER 데이터는 단단한 접합 형성(²² )과 건강한 단층을 나타낸다(그림 5). 이러한 결과는 이 방법으로 분리한 RPE 세포가 인간 RPE와 유사하며 망막 세포 배양 모델에 도움이 될 수 있음을 보여?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody