Culture Dish Coating을 위한 성인 인간 섬유아세포의 심장 세포외 기질 생산

요약

성인 인간의 심장에서 분리된 섬유아세포를 배양하여 젤라틴 코팅된 접시에 합류시켜 심근 특이적 세포외 기질을 생성했습니다. 탈세포화 후, 이 기질은 다른 심장 세포 및 세포-기질 상호 작용의 배양 및 연구에 사용할 수 있습니다.

초록

심근은 심근세포와 훨씬 더 많은 수의 섬유아세포로 구성되어 있으며, 섬유아세포는 세포외 기질 생성을 담당합니다. 심장 발달의 초기 단계부터 일생 동안 정상 상태와 병리학적 상태 모두에서 세포외 기질의 구성은 심근의 구조와 기능을 변화시키고 영향을 미칩니다. 여기에 설명된 방법의 목적은 in vivo에서 심근 세포외 기질을 모방하여 시험관내 심장 세포(심장 ECM이라고 함)의 배양을 위한 기질을 얻는 것입니다. 이를 위해 성인 인간의 심장에서 분리한 섬유아세포를 배양하여 젤라틴으로 코팅된 접시에 합류시켜 심근 특이적 세포외 기질을 생성했습니다. 이후 심장 섬유아세포를 제거한 결과, 침착된 심장 ECM은 보존하면서 심근 특이적 세포외 기질이 다른 세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 기질을 생성했습니다. 중요한 것은 배양 접시의 섬유아세포 유래 코팅 조성이 심장에서 분리된 섬유아세포의 생체 내 활성에 따라 변하여 다양한 정상 및 병리학적 조건에서 세포-기질 상호 작용에 대한 후속 연구를 가능하게 한다는 것입니다.

서문

모든 세포는 생존하고 특정 기능을 수행할 수 있는 특수 미세환경에서 생체 내에 위치합니다. 주어진 조직 내에서 세포는 섬유소 및 비섬유계 단백질로 구성된 세포외 기질과 글리코사미노글리칸이 풍부한 기본 물질로 둘러싸여 있습니다¹. 매트릭스 함량의 정성적 및 정량적 변화는 세포 생물학에 영향을 미치며 세포 증식, 세포 사멸, 이동 또는 분화와 같은 과정을 제어합니다. 따라서 다른 조직의 세포에 대한 시험관 내 연구를 위해 이 미세환경을 재현하는 데 노력이 투자됩니다 ^2,3.

심근은 심근세포(cardiomyocyte)와 훨씬 더 많은 양의 섬유아세포(fibroblast)로 구성되어 있으며, 이들은 심근 내에서 세포외 기질을 생성하고 유지하는 데 중요한 역할을 한다⁴. 일생 동안 세포외 기질의 구성은 다양한 정상 및 병리학적 요인에 반응하여 변할 수 있습니다. 세포외 기질 구성의 이러한 변형은 심근(myocardium5)의 구조와 생체역학적 특성에

프로토콜

심장 이식을 받고 있는 허혈성 심장병증으로 인한 말기 심부전 환자로부터 심장 조직을 얻었습니다. 실험에 사용된 모든 표본은 나폴리 페데리코 2세 대학의 윤리 위원회가 승인한 프로토콜과 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 환자 식별자 없이 환자의 동의하에 수집되었습니다. 연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 준비

1. 멸균 도구/기구 준비: 큰 수술용 가위 1쌍, 미세한 겸자 2세트, 미세해부 가위 2쌍, 1L 멸균 병, 500mL 멸균 병 및 250mL 멸균 병.
2. 22mm x 22mm 커버 안경을 70% 에탄올로 몇 초 동안 소독합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 에탄올을 흡인하고 커버 유리를 37°C의 오븐에서 건조시킨 다음 오토클레이브에서 멸균합니다.
3. 시중에서 판매되는 분말 염을 멸균 이중 증류수에 녹입니다. 1L 멸균 병에 0.35g의 중탄산나트륨 분말을 추가하여 pH 7.4에서 1L의 Hank's Balanced Sal Solution(HBSS)을 준비합니다. 멸균 후드 아래의 0.22μm 필터 멤브레인을 사용하....

토론

인간의 심장 샘플에서 분리한 섬유아세포를 21일 동안 합류하도록 배양하여 세포외 기질을 합성하고 증착하여 배양판 표면에 단단히 부착된 응집력을 형성했습니다. 침착된 심장 ECM을 보존하면서 심장 섬유아세포를 제거한 결과, 심장 조직 내의 다른 세포에 대한 심근 특이적 세포외 기질의 영향을 연구하기 위한 기질이 생성되었습니다.

체외 세포 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes