생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

요약

이 연구는 혈관벽 상주 CD34⁺ 줄기세포(CD34⁺ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

상주 CD34⁺ 혈관벽 상주 줄기 세포(VW-SC)는 혈관 손상 및 복구를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 점점 더 인정받고 있습니다. 기능성 쥐 CD34⁺ VW-SC를 배양하기 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립하는 것은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 이러한 세포의 증식, 이동 및 분화와 관련된 메커니즘을 추가로 조사하는 데 필수적입니다. 설명된 방법은 마그네틱 비드 스크리닝과 유세포 분석을 결합하여 1차 배양 상주 CD34⁺ VW-SC를 정제합니다. 그런 다음 정제된 세포는 면역형광 염색 및 Ca²⁺ 이미징을 통해 기능적으로 식별됩니다. 간략하게, 쥐 대동맥 및 장간막 동맥의 외래에서 혈관 세포는 조직 블록 부착을 통해 얻은 다음 세포 수가 1 × 10⁷ 이상에 도달할 때까지 하위 배양이 이루어집니다. 그 후, CD34⁺ VW-SC는 마그네틱 비드 분류 및 유세포 분석을 사용하여 정제됩니다. CD34⁺ VW-SC의 식별에는 세포 면역형광 염색이 포함되며, 기능적 다능성은 지향적 분화를 위해 세포를 특정 배양 배지에 노출시켜 측정합니다. 또한, ATP, 카페인 또는 탑시가르진(TG)에 노출된 Fura-2/AM 부하 세포에서 상업적으로 이용 가능한 이미징 워크스테이션을 사용하여 기능적 내부 Ca²⁺ 방출 및 외부 Ca²⁺ 진입을 평가합니다. 이 방법은 혈관벽 상주 CD34⁺ 줄기 세포를 분리, 배양 및 식별하기 위한 안정적이고 효율적인 기술을 제공하여 VW-SC의 조절 메커니즘 및 표적 약물 스크리닝에 대한 시험관 내 연구를 위한 기회를 제공합니다.

서문

혈관 벽은 혈관 발달, 항상성 조절 및 혈관 질환의 진행에 중추적인 역할을 합니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 동맥에 다양한 줄기 세포 계통이 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 2004년 Qingbo Xu 교수 그룹은 성인 혈관 벽 주변에 혈관 줄기/전구 세포가 존재한다고 처음으로 보고했으며, CD34, Sca-1, c-kit 및 Flk-1¹을 발현했습니다. 이러한 혈관 줄기 세포는 다방향 분화 및 증식 잠재력을 나타냅니다. 정상적인 조건에서는 상대적으로 조용한 상태를 유지합니다. 그러나 특정 요인에 의해 활성화되면 평활근 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포로 분화할 수 있습니다. 대안적으로, 그들은 파라크린 효과를 통해 혈관 주위 기질 및 미세혈관 형성을 조절하여 손상된 혈관의 수리 또는 개조를 촉진할 수 있습니다 2,3,4,5,6. 최근에는 대퇴동맥 가이드와이어 손상 후 혈관벽에 상주하는 CD34⁺ 줄기세포가 내피세포 재생에 중요한 역....

프로토콜

이 연구는 승인되었으며, 동물은 중국의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 처리되었습니다. 이 연구는 동물윤리위원회(승인번호: SWMU2020664)의 승인을 받아 동물실험의 윤리적 요건을 철저히 준수하였습니다. 본 연구에는 18-20g 무게의 남녀 8주 된 건강한 C57BL/6 마우스가 활용되었습니다. 동물들은 사우스웨스트 의과대학(SWMU)의 실험동물센터에 수용되었다.

1. 대동맥 및 장간막 동맥에서 외래의 조직 블록 배양

1. 상주 CD34⁺ VW-SC 절연
   1. 3% 이소플루란 흡입으로 두 마리의 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 발가락 꼬집으로 적절한 마취를 확인합니다. 의료용 테이프로 쥐를 누운 위치에 놓고 70% 에탄올 소독제를 뿌려 쥐의 털을 소독합니다. 멸균 안과 가위와 집게를 사용하여 흉강과 복강을 열어 심장과 장을 노출시킵니다. 분리된 대동맥과 장간막 동맥을 절개한 후 대동맥과 장간막 침대를 실리콘 엘라스토머가 들어 있는 페트리 접시에 고정하고 생리학적 염 용액으로 채웁니다. 다른 멸균 된 가위와 겸자 세트를 사용하여 대동맥과 장간막 동맥 주변의 지방을 빠르게 절개하십시오.
   2. 절개된 조직을 1% 페니실린-스트렙토마....

토론

이 연구는 마우스의 대동맥 및 장간막 동맥에서 기능적 CD34⁺ VW-SC를 얻는 빠르고 편리한 방법을 제공합니다. 이 방법으로 얻어진 CD34⁺ VW-SC는 증식 활성과 다방향 분화 특성을 갖는다. 트리포스페이트 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체(IP₃Rs), 리아노딘 수용체(RyRs) 및 매장 작동 칼슘 채널은 CD34⁺ VW-SC에서 Ca²⁺ 방출 및 진입을 매개합니다. 이 기술의 확립?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023