조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

요약

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

초록

단일 세포 염기서열 분석은 조혈 장기의 기질에서 이질적인 세포 집단을 매핑할 수 있게 해주었습니다. 이러한 방법론은 정상 상태에서 이전에 해결되지 않은 이질성뿐만 아니라 외적 스트레스 또는 노화 중에 유발된 세포 유형 표현의 변화를 연구할 수 있는 렌즈를 제공합니다. 여기에서는 쥐와 인간의 흉선, 쥐 뼈 및 골수에서 고품질 기질 세포 집단을 분리하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜을 통해 분리된 세포는 고품질 단일 세포 멀티오믹스 데이터 세트를 생성하는 데 적합합니다. 여기에서는 시료 분해의 영향, 조혈 계통 고갈, FACS 분석/분류 및 이러한 요인이 단일 세포 염기서열분석과의 호환성에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 성공적이고 비효율적인 해리를 나타내는 FACS 프로파일과 염기서열분석 후 분석에서 다운스트림 기질 세포 수율의 예를 통해 사용자가 인식할 수 있는 포인터가 제공됩니다. 기질 세포의 특정 요구 사항을 고려하는 것은 해당 분야의 지식을 발전시킬 수 있는 고품질의 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.

서문

건강한 성인의 경우, 골수와 흉선에서 혈액 세포의 새로운 생성이 발생합니다. 이 부위의 기질 세포는 조혈 유지에 필수적이지만 기질은 조직 ^1,2,3,4의 1% 미만을 구성합니다. 따라서 기질을 지지하는 조혈의 순수 분리물을 얻는 것은 특히 고품질 샘플을 얻기 위해 편리한 처리가 필요한 단세포 다생물체학의 경우 상당한 도전이 됩니다. 다양한 분해 칵테일의 구성 요소는 멀티오믹스 분석의 특정 단계를 방해할 수 있습니다 ^5,6. 여기에 제시된 프로토콜은 골수 및 흉선 조직에서 다양한 기질 세포를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

골수와 흉선의 기질 구성 성분의 교란은 혈액 세포 발달에 심각한 혼란을 초래하고 악성 종양을 초래할 수 있습니다 ^7,8,9.....

프로토콜

인체 조직을 사용한 모든 작업은 Massachusetts General Hospital Internal Review Board(IRB)의 승인을 받은 후 수행되었습니다. 모든 동물 시술은 Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 8-10주 된 C57Bl/6마리의 마우스와 수컷 모두가 사용되었습니다. 동물은 상업적인 출처에서 얻었다( 재료 표 참조).

1. 쥐 흉선 조직의 준비

1. 다음 버퍼와 용액을 준비합니다.
   1. 미디엄 199(M199), 2%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)( 재료 표 참조).
   2. 쥐 해리 칵테일: M199 + 2% FBS에서 0.5 WU/mL Liberase TM 및 6.3 U/mL DNase I( 재료 표 참조).
   3. M199와 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA).
      참고: FBS 함유 배지는 RNA 품질을 향상시키기 위해 BSA로 전환할 수 있습니다.
2. 쥐....

토론

조혈 장기의 기질 세포는 정상적인 혈액 생성에 중요하며, 조혈 기질 섭동은 조혈 유지 및 스트레스에 대한 반응에 심각한 장애를 초래할 수 있다 ^9,23,24. 조혈 기질 세포에 대한 통찰력은 혈액 질환을 이해하는 데 필수적입니다 7,9,10,24 및 이를 퇴치하기 위한 치료법을

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107