삶의 극한에서의 적응 : 극한 고령 Archaeon Sulfolobus acidocaldarius를 사용한 실험적 진화

요약

여기에서는 저비용의 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 인큐베이터로 활용하는 호열성의 적응을 위한 실험적 진화 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 최적 성장 온도가 75 °C인 고세균인 Sulfolobus acidocaldarius의 온도 적응 특성화를 통해 입증되었습니다.

초록

고세균 Sulfolobus acidocaldarius 는 유망한 호열성 모델 시스템으로 부상했습니다. 호열식물이 온도 변화에 어떻게 적응하는지 조사하는 것은 기본적인 진화 과정을 이해하는 것뿐만 아니라 S. acidocaldarius 를 생명공학의 섀시로 개발하기 위한 핵심 요구 사항입니다. 호열성으로 실험적 진화를 수행하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 고온 성장을 위한 기존 인큐베이터의 장비 유지 관리 및 에너지 사용 비용입니다. 이 문제를 해결하기 위해 저비용 및 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 사용하여 S. acidocaldarius 에서 실험 진화를 수행하기 위한 포괄적인 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜에는 상대적으로 적은 부피(1.5mL)의 배치 배양 기술이 포함되어 있어 여러 독립적인 계통에서 적응을 추적할 수 있습니다. 이 방법은 추가 열혼합기를 사용하여 쉽게 확장할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 실험 조사와 관련된 초기 투자 및 지속적인 비용을 모두 줄임으로써 모델 시스템으로서 S. acidocaldarius 의 접근성을 높입니다. 또한, 이 기술은 다양한 환경 조건에 대한 적응을 탐구하기 위해 다른 미생물 시스템으로 이전할 수 있습니다.

서문

지구상의 초기 생명체는 극도로 높은 온도와 산성도를 특징으로 하는 열수 분출구와 같은 극한 환경에서 기원했을 수 있다¹. 미생물은 온천과 화산 솔파타라를 포함한 극한 환경에서 계속 서식하고 있습니다. 이러한 극한 조건에서 발생하는 진화 역학을 특성화하는 것은 이러한 조건에서 생존을 가능하게 하는 특수한 생리학적 과정에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다. 이는 생물 다양성의 기원에 대한 이해부터 생명공학적 응용을 위한 새로운 고온 효소 개발에 이르기까지 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.

극한 환경에서의 미생물 진화 역학에 대한 이해는 그 중요한 중요성에도 불구하고 제한적인 상태로 남아 있습니다. 대조적으로, 중온성 환경에서의 진화에 대한 중요한 지식은 실험적 진화로 알려진 기술의 적용을 통해 획득되었습니다. 실험적 진화는 실험실 조건 ^2,3,4,5 하에서 진화적 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 종종 여기에는 정의된....

프로토콜

1. S. acidocaldarius 성장 배지(BBM⁺)의 제조

참고: S. acidocaldarius를 배양하기 위해 이 프로토콜은 Basal Brock Medium (BBM⁺)²³을 사용합니다. 이것은 먼저 아래에 설명된 무기 원액을 결합하여 BBM^-을 생성함으로써 준비되며, 이는 미리 준비될 수 있습니다. 그런 다음 BBM⁺ 는 BBM⁻에 유기 원액을 추가하여 필요에 따라 준비됩니다. 원액 레시피는 표 1에도 제시되어 있습니다. 모든 배지 및 스톡 용액은 이중 증류된 H₂O (ddH₂O)로 준비해야 합니다.

1. 성장 매체를 위한 무기 재고 솔루션 준비
   1. 미량 원소 원액을 준비합니다.
      1. ddH₂O에 9g / L의 테트라 보산 나트륨 데카 하이드레이트 (Na₂B₄O₇·10H₂O....

토론

이 연구는 호열성을 위한 실험적 진화 프로토콜을 개발했으며, 여기서는 고세균 S. acidocaldarius에 맞게 조정되었지만 고온 성장 요구 사항이 있는 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기에 중온성 박테리아를 위해 설계된 기술을 기반으로 하지만 고온 호기성 성장 ^2,4,5,24

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.