FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정

요약

내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.

초록

내재적 무질서 영역(IDR)은 중요한 세포 과정에 관여하는 단백질 영역입니다. 스트레스 조건 동안 세포 환경의 물리화학적 특성이 변하여 IDR의 구조적 앙상블에 직접적인 영향을 미칩니다. IDR은 본질적으로 환경 섭동에 민감합니다. 세포의 물리화학적 특성이 IDR의 구조적 앙상블을 어떻게 조절하는지 연구하는 것은 IDR 기능의 환경적 제어를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 고삼투압 스트레스 조건에 반응하여 살아있는 맥주효모균 세포 에서 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 단계별 방법을 설명합니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 삼투질이 있는 세포에 가해지는 고삼투압 스트레스가 점진적으로 증가하는 동안 IDR의 전체 치수가 어떻게 변하는지 추정합니다. 또한 형광 측정을 처리하고 다양한 IDR에 대한 구조적 감도를 비교하기 위한 스크립트를 제공합니다. 이 방법을 따름으로써 연구자들은 환경 변화에 따라 복잡한 세포 내 환경에서 IDR이 겪는 구조적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

서문

본질적으로 무질서한 영역(Intrinsically disordered regions, IDR)은 세포 과정의 중요한 구성 요소입니다¹. 구조화된 도메인과 함께 IDR은 단백질 기능에 필수적입니다. IDR의 아미노산 조성은 편향되어 있으며, 주로 하전, 친수성 및 작은 잔류물로 대표됩니다. 이 속성 때문에 IDR은 복잡성이 낮은 도메인 ^2,3으로 간주됩니다. 수많은 IDR이 주목을 받고 있는데, 이는 주로 이 부위가 병리학적 상태, 특히 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 하기 때문입니다. 이러한 질환은 뉴런에서 IDR의 자가 조립(self-assembly)과 그에 따른 세포외 또는 세포내 침착(extracellular 또는 intracellular deposition)을 특징으로 한다⁴. 이러한 IDR의 예로는 알츠하이머병의 아밀로이드-β(Aβ), 헌팅턴병의 헌팅틴(HTT), 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 치매의 육종(FUS)에서 융합된 TAR DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 및 융합 등이 있다⁴. 질병의 맥락에서 IDR의 구조적 재배열에 대한 연구는....

프로토콜

1. 플라스미드 구성

1. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 원하는 IDR을 코딩하는 개방형 판독 프레임(ORF)을 증폭합니다. ORF는 형광 단백질을 암호화하는 유전자 옆에 있기 때문에 정지 코돈을 포함하지 마십시오. 증폭을 위해 SacI(5') 및 BglII(3') 제한 부위를 사용하여 프라이머를 설계합니다.
   참고: 대표 결과 섹션의 경우 AtLEA4-5를 선택한 IDR로 사용했습니다. pTrc99A-AtLEA4-5 플라스미드¹²에서 AtLEA4-5의 ORF를 증폭했습니다.
2. ORFPCR 산물을 Sac I 및 BglII 효소¹³으로 연속 제한하여 절단한다.
3. Addgene(https://www.addgene.org/178189/)에서 상용 플라스미드 pDRFLIP38-AtLEA4-5(#178189)를 얻습니다.
4. Sac I 및 BglII 효소를 사용하여 pDRFLIP38-AtLEA4-5 플라스미드에서 AtLEA4-5 ORF를 제거하고, FRET 쌍¹³을 포함하는 개방 플....

토론

여기에 제시된 방법은 IDR 앙상블의 전역 차원이 환경 섭동을 감지하고 반응하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 유전적으로 인코딩된 구조에 의존하며 효모 세포에서 플라스미드 안정 발현 이외의 추가 구성 요소가 필요하지 않으므로 다른 세포 유형의 잠재적 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 또한, 진핵 세포가 수명주기 동안 경험하는 다른 물리 화학적 섭동?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500