성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

요약

성체 제브라피시에서 새로운 복강내(IP) 주사 방법에 대해 설명합니다. 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성 화합물을 취급할 때 이 절차는 이전에 보고된 두 가지 IP 방법보다 더 효과적입니다. 이 기술은 제브라피시 모델에 대한 경험이 제한된 연구원들이 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었습니다.

초록

유전적으로 접근할 수 있는 성체 제브라피시(Danio rerio)는 심근병증과 같은 인간 질환을 연구하는 데 귀중한 척추동물 모델로 활용되고 있습니다. 복강내 (IP) 주사는 치료 효과를 테스트하거나 독소루비신 유발 심근병증(DIC)과 같은 질병 모델을 생성하기 위해 화합물을 신체에 전달하는 중요한 방법입니다. 현재 IP 주입에는 두 가지 방법이 있습니다. 두 방법 모두 독소루비신과 같은 독성 화합물을 다룰 때 한계가 있으며, 이로 인해 신체 형태에 심각한 손상이 발생하고 물고기가 폐사하는 부작용이 나타납니다. 이러한 단점은 광범위한 연구자 교육으로 극복할 수 있지만 부작용이 최소화된 새로운 IP 주입 방법이 바람직합니다. 여기에서는 독성 화합물을 처리할 수 있는 고유한 IP 주입 방법이 보고됩니다. 심장 기능이 지속적으로 저하되면 심각한 물고기 폐사로 이어지지 않을 수 있습니다. 이 기술은 성인 제브라피쉬에 대한 경험이 거의 없는 연구원이 쉽게 마스터할 수 있습니다.

서문

제브라피시(Danio rerio)는 인간에 대한 높은 유전자 및 장기 상동성, 외부 수정, 유전자 조작의 용이성, 조기 성숙에 대한 신체 투명성을 포함하기 때문에 인간의 질병을 연구하기 위한 실험 모델로 주목받고 있습니다¹. 제브라피시 배아와 유충을 위해 약물을 직접 물에 전달하는 간단한 과정과 달리, 성체 제브라피시에게 약물을 투여하는 것은 더 복잡하고 도전적인 노력을 제시한다².

성체 물고기에서 화합물은 물에 직접 투여하는 것과 같은 수동적 약물 전달 기술 또는 gavaging과 같은 경구 약물 전달 방법을 통해 전달될 수 있습니다². 다른 접근법으로는 어류에 화합물을 코팅한 후 물고기에게 먹이를 주는 방법³, 후안와 주사 또는 복강내 주사를 포함하여 미리 결정된 농도로 수불용성 약물을 직접 투여하는 방법이 있다 ^4,5. 복강내 투여는 뚜렷한 약동학적 이점으로 인해 질병 모델의 생체 내 연구에서 선호됩니다

프로토콜

수행된 모든 절차는 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals'(National Academies Press, 2011)에 설명된 표준을 준수했습니다. 연구에 참여한 모든 제브라피쉬는 WIK(Wild Indian Karyotype) 균주에 속합니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 독소루비신 원액의 준비 및 보관

1. 상업적인 출처에서 독소루비신 주식을 얻으십시오.
   참고: 독소루비신은 빛에 민감하므로 빛에 노출되지 않도록 분말 형태로 구입하여 불투명한 용기에 보관하십시오. 화학 후드 내에서 Dox 분말 준비를 위한 모든 단계를 수행합니다.
2. Dox 분말을 증류수에 완전히 용해시키고 최종 농도가 5mg/mL인 원액을 준비합니다.
3. 스톡을 1.5mL 튜브로 나누어 분취합니다.
4. 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출되지 않도록 보호합니다.
5. 분취액 Dox 용액을 단기 보관(<1개월)의 경우 4°C,....

토론

기존의 두 가지 IP 주입 방법 ^4,10과 달리 새로운 IP 주입 방법은 다음과 같은 뚜렷한 특징이 있습니다. 첫째, 고유한 바늘 침투 각도가 사용됩니다(0에 가까움). 둘째, 바늘은 독특한 위치, 즉 물고기의 복부 표면에 있는 자연적인 구멍을 통해 물고기를 관통하여 주입을 용이하게 합니다. 마지막으로 바늘의 움직임은 앞쪽에서 뒤쪽으로 이루어집니?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL NanoFil-syringe	World Precision Instruments, Inc	NANOFIL	injection tool
34 G needle	World Precision Instruments, Inc	NI34BV-2	injcetion tool
60 mm Petri dish	fisher scientific/fisherbrand	FB0875713A	placing the sponge
Dissecting microscope	Nikon	SMZ800	Injceting the Dox
Doxorubicin hydrochloride	Sigma	D1515-10MG	drug for creating DIC model
Echocardiography	VISUAL SONICS	Vevo 3100	measuring cardiac function
Foam Sponge	Jaece Industries	L800-D	placing the fish
Hank's balanced salt solution (HBBS)	Thermo Fisher	14025076	Vehicle for Dox
Microcentrifuge	southernlabware	MyFuge/C1012	collect the Dox solution
Precision Balance Scale	Torbal	AD60	Digital scales
Tricaine	Argent	MS-222	Anesthetizing fish
Tube	Eppendorf	1.5 mL	storage
vevo LAB  software	FUJIFILM VISUAL SONICS	5.6.0	quantification of the heart