Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis를 통한 Sipunculus nudus 의 활성 Fibrinogenolytic Agents의 신속한 분리 및 표시

요약

여기에서는 Sipunculus nudus의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하기 위한 피브리노겐-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 프로토콜을 제시합니다.

초록

피브리노겐을 직접 용해시킬 수 있는 섬유소 용해제는 항응고 치료에 널리 사용되고 있습니다. 일반적으로 새로운 섬유소 용해제를 식별하려면 먼저 각 구성 요소를 분리한 다음 이들의 섬유소 용해 활성을 확인해야 합니다. 현재 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 크로마토그래피는 주로 분리 단계에서 사용됩니다. 한편, 피브리노겐 플레이트 분석 및 반응 생성물 기반 PAGE는 일반적으로 섬유소 용해 활성을 표시하기 위해 채택됩니다. 그러나 이 두 단계의 시공간 분리로 인해 동일한 겔로 활성 섬유소 용해제를 분리하여 표시하는 것은 불가능합니다. 본 연구에서는 섬유소 용해제 식별의 분리 및 표시 과정을 단순화하기 위해 땅콩 벌레(Sipunculus nudus)의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하는 새로운 fibrinogen-PAGE 방법을 구축했습니다. 이 방법에는 fibrinogen-PAGE 준비, 전기 영동, renaturation, incubation, staining 및 decolorization이 포함됩니다. 단백질의 섬유소 용해 활성과 분자량을 동시에 검출할 수 있습니다. 이 방법에 따르면 6시간 이내에 땅콩 웜호질제네이트의 활성 섬유소 용해제를 두 개 이상 성공적으로 검출했습니다. 또한 이 fibrinogen-PAGE 분석법은 시간과 비용이 절약됩니다. 또한, 이 방법은 다른 유기체의 섬유소 용해제를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

서문

최근 몇 년 동안 혈전성 질환의 지속적인 증가로 인해 혈전성 질환은 새로운 주요 글로벌 건강 문제가 되었습니다¹. 현재 항혈전제는 항혈소판응집제, 항응고제, 혈전용해제의 세 그룹으로 분류됩니다. 그 중에서도 urokinase(영국), tissue plasminogen activator(tPA) 등과 같은 혈전용해제는 혈전 2를 가수분해할 수 있는 유일한 임상용 약물^입니다. 한편, 새로운 혈전용해제의 확인에 의해 보다 안전하고 효과적인 혈전용해제가 개발되고^{있다 3}.

그러나 새로운 혈전용해제를 식별하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며, 주로 분리/정제 및 특성화/확인 단계가 포함됩니다. 전자는 각 구성 요소를 분리하는 것이고 후자는 피브리노(유전자) 용해 활성을 표시하는 것입니다 ^4,5. 이전 연구에서 친화성 크로마토그래피 및 피브린(ogen) 플레이트 분석

프로토콜

1. 땅콩 벌레 균질화 제조

1. 땅콩 벌레 50g과 식염수 150mL를 균질기에 넣습니다.
2. 24000rpm에서 60초 동안 균질화합니다.
   알림: 3회 반복합니다.
3. 9710 x g 에서 균질액을 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
4. 추가 연구를 위해 상층액을 땅콩 벌레 균질액으로 수집합니다.

2. Fibrinogen-PAGE 겔 준비

1. 50mL 유리 비커에 0.01g의 피브리노겐을 무게를 잰다.
2. 1.9mL의 DDH_2O, 1.3mL의 Tris-HCl(1.5M, pH 8.8) 및 0.05mL의 SDS(10%, w/v)를 비커에 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞는다.
3. 비커를 37°C에서 30분 동안 놓습니다.
   참고: 이 단계는 피브리노겐을 용해시키는 것입니다.
4. 아크릴아마이드 1.7mL(30%, w/v), 과황산암모늄(APS; 10%, w/v) 0.05mL, TEMED 0.002mL를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞는다.
   알림: 이것은 분....

토론

sFE는 우리 팀이 이전에 ^3,6,8,13에 의해 땅콩 벌레에서 분리 한 새로운 fibrino (geno) 용해 효소입니다. 그러나 sFE의 식별 프로세스는 섬유소 용해 활성 검출, 단백질 구성 요소 분리 및 활성 확인 단계를 포함하여 시간과 노동력이 많이 소요되었습니다. 간단한 방법으로, fibrinogen p.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200