Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

요약

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

초록

인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)는 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 이들의 재생 기능은 세포 간 접촉 및 세포 측분비 효과에 기인할 수 있습니다. 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 방법이며, 여기서 세포외 소포체(EV)는 운반체로서 기능적인 역할을 합니다. 재생 의학 분야에서 ADSC EV는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 여러 연구에서 이러한 방법의 효과에 대해 보고했습니다. EV를 추출하고 분리하는 다양한 방법은 현재 원심분리, 침전, 분자 크기, 친화도 및 미세유체역학과 같은 원리를 기반으로 설명됩니다. 초원심분리는 EV를 분리하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 초원심분리 중 예방 조치를 강조하기 위한 세심한 프로토콜은 여전히 부재합니다. 이 연구는 ADSC 배양, 상층액 수집 및 EV 초원심분리와 관련된 방법론과 중요한 단계를 제시합니다. 그러나 초원심분리가 비용 효율적이고 추가 치료가 필요하지 않음에도 불구하고 낮은 회수율 및 EV 응집과 같은 몇 가지 불가피한 단점이 여전히 있습니다.

서문

대부분의 ADSC는 지방 조직에서 유래하며 심근, 뼈 및 피부를 포함한 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진하는 것으로 입증되었습니다¹. 최근 연구에 따르면 ADSC의 재생 기능은 세포 간 접촉과 세포의 파라크린 효과에 기인할 수 있습니다². 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 수단이며, 이 기능은 세포외 소포체(EV)를 통해 달성됩니다.

EV는 셀에 의해 생성되는 이중층 멤브레인 구조로, 직경이 40nm에서 160nm(평균 약 100nm) 사이입니다. 그들은 사이토카인 생산, 세포 증식, 세포 사멸 및 신진 대사와 같은 다양한 세포 기능에 영향을 미칩니다 ^3,4. 뼈 재생 촉진, 구강 점막 조직 재생, 조직 이식 후 지방 조직 생존, 피부 상처 복구를 포함한 ADSC EV의 기능에 대한 수많은 연구가 수행되었습니다 5,6,7,8.

프로토콜

프로토콜 단계의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미디어 준비

1. 기초 배양 배지 450mL, 엑소좀이 없는 소 태아 혈청 50mL, 삼중 항생제 5mL를 사용하여 엑소좀이 없는 ADSC용 배양액을 준비합니다.

2. ADSC의 소생 및 배양

알림: ADSC를 소생시킵니다.

1. 매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.
2. 미리 37°C 수조에서 매체를 예열합니다.
3. 액체 질소에서 동결된 ADSCs(P2) 튜브 3개를 회수하고 완전히 해동될 때까지 일정한 온도의 37°C 수조에서 교반합니다.
   알림: 냉동 튜브의 입구는 오염을 방지하기 위해 물과 접촉하지 않아야 합니다.
4. 75% 알코올을 사용하여 냉동 보존 튜브를 소독한 다음 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입하고 15mL 원심분리 ....

토론

공식적인 실험 과정에서 최상의 실험 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 사항이 중요합니다. 이전 경험에 비추어 볼 때 가능한 최상의 세포 상태를 보장하는 통로 3-6 ADSC를 선택하는 것이 좋습니다. P3 이전에는 적혈구, 내피 세포 및 기타 기타 세포가 스크리닝되지 않았을 수 있습니다. P6 이후에는 세포가 점차 노화될 수 있으며, 이는 분비된 EV의 상태에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 가능한 한 많은.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410