신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

요약

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

초록

성체 쥐에서 골수를 분리하기 위한 다양한 기술이 잘 확립되어 있습니다. 그러나 신생아 마우스에서 골수를 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리지만, 일부 모델의 경우 번역학적으로 관련성이 있고 필요합니다. 이 프로토콜은 7-9일 된 새끼의 골수 세포를 준비하기 위한 효율적이고 간단한 방법을 설명합니다. 그런 다음 이러한 세포를 추가로 분리하거나 특정 관심 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 대식세포는 염증과 감염에 중요한 역할을 하는 중요한 면역 세포입니다. 발달 과정에서 신생아 대식세포는 조직 리모델링에 크게 기여합니다. 또한, 신생아 대식세포의 표현형과 기능은 성인 대식세포의 표현형과 기능이 다릅니다. 이 프로토콜은 또한 L929 컨디셔닝 배지가 있는 상태에서 분리된 골수 세포와 신생아 대식세포의 분화를 설명합니다. 분화된 신생아 대식세포에 대한 표면 마커는 유세포 분석을 사용하여 평가되었습니다. 기능성을 입증하기 위해 phagocytic efficiency는 pH 민감성 염료 접합 Escherichia coli를 사용하여 테스트했습니다.

서문

골수는 조혈모세포군과 중간엽줄기세포 집단을 모두 둘러싸고 있으며, 이들은 자가 재생이 가능하고 다양한 세포계로 분화할 수 있습니다. 골수에 있는 조혈모세포는 골수성 및 림프구 계통을 생성한다¹. 중간엽 줄기세포는 골아세포(뼈), 지방세포(지방) 또는 연골세포(연^골)를 생성합니다2. 이 세포는 유전자 치료 ^3,4를 포함하여 세포 생물학 및 조직 공학 분야에서 여러 응용 분야를 가지고 있습니다. 골수에 존재하는 전구 세포는 계통 특이적 성장 인자의 존재 하에 특정 세포 유형으로 분화합니다. 에리트로포이에틴(Erythropoietin)은 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)의 증식을 촉진하고, 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)는 호중구 집락의 성장을 촉진하며, 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은 혈소판 생성을 조절하는 계통 특이적 성장 인자(lineage-specific growth factor)의 몇 가지 예이다⁵. FA....

프로토콜

모든 절차는 West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees의 승인을 받았으며 National Research Council의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 연구에는 C57BL/6J 새끼 쥐가 사용되었습니다. 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미디어 준비

1. 10% FBS, 2mM 글루타민, 25mM HEPES 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 MEM 배양 배지 3mL를 5mL 원심분리기 튜브에 준비하고 얼음에 보관합니다.
2. 골수 전구 세포를 액체 질소에 보관해야 하는 경우 10% DMEM, 80% FBS 및 10% DMSO를 포함하는 냉동 배지를 준비합니다.
3. 완전한 DMEM을 위해 10% FBS, 2mM 글루타민, 25mM HEPES 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 DMEM을 준비합니다.
4. 대식세포 분화를 위해 10% FBS, 2mM 글루타민, 페니실린....

토론

신생아 마우스 모델과 관련된 연구는 여러 가지 과제를 제시할 수 있습니다. 신생아는 성인에 비해 독특한 면역 체계가 발달하고 있다⁸. 따라서 성체 동물 모델에서 생성된 데이터는 신생아에게 적용되는 것으로 가정해서는 안 되며, 여러 출판된 연구에서 이 아이디어를 잘 표현했습니다^18,19. 따라서 신생아 특이적 모델과 세포의 출처.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal