환자 유래 종양 오가노이드에서 세포 방사선 민감도를 정량화하기 위한 Live Imaging

요약

여기에서는 전리 방사선에 대한 환자 유래 종양 오가노이드의 민감도를 정량화하기 위한 간단한 실시간 이미징 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

초록

방사선 치료(RT)는 현대 임상 암 관리의 핵심 중 하나입니다. 그러나 모든 암 유형이 방사선 조사에 똑같이 민감한 것은 아니며, 이온선에 의해 유도된 산화적 DNA 손상을 복구하는 악성 세포의 능력의 차이 때문에 종종(항상 그런 것은 아님) 방사선 조사에 민감합니다. Clonogenic assay는 이온화 방사선 조사에 대한 배양 암세포의 민감도를 평가하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔는데, 이는 주로 방사선 조사된 암세포가 단기 유세포 분석 또는 현미경 보조 기술로 정량화하기 어려운 지연된 방식으로 죽기 때문입니다. 안타깝게도, 클론생성 분석은 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)와 같은 더 복잡한 종양 모델에는 사용할 수 없습니다. 실제로, 확립된 PDTO를 조사하는 것은 줄기와 같은 구획이 완전히 제거되지 않는 한 다세포 단위로서의 성장을 반드시 포기하지는 않을 수 있습니다. 더욱이, PDTO 유래 단일세포 현탁액을 조사하는 것은 확립된 PDTO의 맥락에서 RT에 대한 악성 세포의 민감도를 적절하게 재현하지 못할 수 있다. 여기에서는 확립된 PDTO를 전리 방사선에 노출시키는 것과 관련된 기존 클론 생성 분석의 적응에 대해 자세히 설명한 다음 단일 세포 해리, 적절한 배양 조건에서의 도금 및 실시간 이미징을 수행합니다. 방사선 조사되지 않은(대조) PDTO 유래 줄기 세포는 PDTO 특이적 효율로 성장하는 PDTO를 재형성하며, 이는 용량 의존적 방식으로 방사선 조사에 의해 부정적인 영향을 받습니다. 이러한 조건에서, PDTO 형성 효율 및 성장률은 제어 PDTO가 사전 정의된 공간 점유를 달성할 때까지 수집된 타임랩스 이미지에 대한 방사선 민감도의 척도로 정량화할 수 있습니다.

서문

외부 빔 방사선 치료(RT)는 현대 종양학의 주류를 이루는 방법 중 하나로, 일반적으로 관리 가능한 부작용의 잘 정의된 스펙트럼과 관련된 뚜렷한 항암 활성을 반영할 뿐만^{아니라1 예외}적으로 널리 퍼진 임상적 가용성(선진국의 대부분의 암 센터에는 외부 빔 RT를 위한 최신 선형 가속기가 장착되어 있음)^을 반영합니다2. 이러한 개념에 따라, RT는 일반적으로 초기 단계^{의 질병3,4}과 전이성 종양으로 인한 증상(예: 통증)을 억제하기 위한 완화적 응용 프로그램 모두에서 전 세계적으로 성공적으로^{사용되고 있다5}. 즉, 모든 악성 종양이 RT에 동등하게 민감한 것은 아니며, 이는 암세포의 내재적 및 미세환경적 특징을 반영합니다 6,7,8,9. 독립적인 예로서, DNA 복구 및 산화 환원 ....

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 오가노이드 배양

참고: TNBC#1 PDTO는 삼중음성 유방암(TNBC) 환자로부터 수술로 제거된 종양 조직을 기반으로 우리 실험실에서 확립되었으며, 환자는 바이오뱅킹 프로토콜(IRB21-06023682)에 참여하기 위해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 조직학 및 RNA 염기서열분석(RNAseq)에 의한 검증 후, TNBC#1 PDTO는 농축된 DMEM/F12 배양 배지(표 1)의 66% 마트리겔 방울(소위 '돔')에서 배양되고 1:2-1:10 비율로 2-3주마다 통과한다²⁸.

1. 방사선 조사 약 2주 전에 1:2-1:10 비율로 PDTO를 별도의 비부착 6웰 플레이트에 파종하며, 테스트한 각 방사선 선량당 하나씩 파종합니다(전리 방사선에 노출되지 않은 PDTO에서 제공되는 음성 대조군 포함).
2. 3-4일마다 3mL의 신선하게 농축된 DMEM/F12 배양 배지를 PDTO에 추가합니다.
   참고: 파종 ....

토론

여기에서는 (1) 시험관 내 PDTO 방사선 조사 시 PTDO 형성 줄기 유사 세포의 지속성 및 (2) 이러한 세포가 생성할 수 있는(가능한) PDTO의 성장 속도를 기반으로 PDTO 방사선 민감도를 정량화하기 위해 유방암 PDTO와 실시간 이미징을 활용하는 기존 클론생성 분석의 적응에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 (1) 양호한 생존력을 가능하게 하는 돔 점유에 대한.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049