저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증

요약

여기에서는 저산소증 민감성 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 생성 및 기능 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 렌티바이러스 기반 생성과 저산소증 의존성 CAR 발현 및 선택적 세포 독성의 검증을 포함한 특성 분석을 제시합니다.

초록

광범위한 연구를 통해 혈액 악성 종양 치료에 있어 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료의 가능성을 입증했습니다. 그러나 고형 종양의 치료는 여전히 어려운 과제이며, 이는 CAR-T 세포가 표적 항원을 발현하는 정상 세포를 공격할 때 발생하는 안전성 문제에서 알 수 있습니다. 연구자들은 CAR-T 세포 치료제의 종양 선택성을 향상시키기 위해 다양한 접근법을 탐구해 왔습니다. 이와 관련된 대표적인 전략 중 하나는 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 구축으로, 이 세포는 산소 의존적 분해 도메인을 CAR 부분에 융합하여 설계되고 저산소 환경인 종양 미세환경(TME)에서만 높은 CAR 발현을 달성하도록 전략화됩니다. 이 논문은 이동식 인큐베이터 챔버에 의해 설정된 다양한 산소 농도에 대한 CAR 발현 및 사멸 능력의 변화를 분석하는 방법을 포함하여 이러한 CAR-T 세포의 생성 및 기능적 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 구축된 CAR-T 세포는 산소에 민감한 방식으로 CAR 발현 및 세포 독성을 입증할 것으로 예상되며, 이를 통해 선택적 활성화를 위해 저산소 TME와 정상 정상 조직을 구별할 수 있는 능력을 지원할 수 있습니다.

서문

키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료는 암 치료에서 중요한 돌파구를 제시했습니다. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 진행성/저항성 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병 치료를 위한 최초의 CAR-T 치료제를 승인한 이래 전 세계적으로 CD19 또는 B세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하는 CAR-T 치료제 ^1,2,3,10개가 승인을 받았다⁴. 그러나 광범위한 연구에도 불구하고 혈액 악성 종양 치료에서 CAR-T 요법의 놀라운 효능을 재현하는 것은 고형 종양에 적용하는 데 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다 5,6,7,8.

면역억제 종양미세환경(TME)은 고형 종양 환경에서 CAR-T의 낮은 효능에 ....

프로토콜

이 연구에서는 HER2(유전자 ID: 2064)를 표적으로 하는 저산소증 민감성 CAR인 HER2-BBz-ODD를 일반 CAR2-BBz와 비교했습니다. 두 CAR의 개략도는 그림 1A에 나와 있으며, 이는 HER2-BBz-ODD가 ODD 시퀀스를 CD3ξ의 C-터미널에 추가하여 HER2-BBz에서 파생됨을 보여줍니다. 두 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축과 293T 세포 transfection에 의한 해당 렌티바이러스의 생성은 이전에 설명되었습니다³¹.

1. 렌티바이러스 감염에 의한 저산소증 민감성 CAR-T 세포 생성

1. 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수조에서 37°C에서 빠르게 해동합니다. 해동된 PBMC를 400IU의 IL-2, 5ng/mL IL-7 및 10ng/mL IL-15(인간 T 세포 성장 배지, 이후 TGM 이라고 함)가 보충된 9mL의 무혈청 림프구 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다.
2. 세포 계수를 위해 부분....

토론

안전성 문제는 모든 CAR-T 세포 치료제가 임상적으로 사용되기 위해 반드시 해결해야 하는 중요한 문제입니다. 종양 세포 또는 TME의 고유한 특성을 활용하는 것이 주요 연구 방향이 되었으며, 종양 조직을 선택적으로 표적으로 하는 CAR-T 세포 개발에 중점을 두고 있습니다. 저산소증에 민감한 CAR-T를 설계하는 것은 이 방향에서 매력적인 전략이며, 이 연구에서 제시된 CAR 부.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Step 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Cell culture Protocol Step 4
10 mL pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Cell culture Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates	Greiner	655090	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
96-well ELISA plates	Corning	3590	ELISA Protocol Step 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator	Thermo Scientific	360	Cell culture Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate	Hausser scientific	1492	Cell counting Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Cell culture Protocol Step 4
Electronic balance	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protocol Step 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Cell culture Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	luciferase activity measurement Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge	eppendorf	5810 R	Cell culture Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cells culture Protocol Step 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cells culture Protocol Step 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cells culture Protocol Step 1
Inverted microscope	Olympus	CKX41	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protocol Step 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flow cytometry Protocol Step 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader	BioTek	HTX	ELISA Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B)
NovoNectin -coated 48-well flat plates	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T cells construction Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set	Sigma	P9187	Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Flow cytometry Protocol Step 2
Protamine sulfate	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus infection Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protocol Step 3
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	566685	T Cells culture Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T Cells culture Protocol Step 1
PVDF membrane	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Step 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Protocol Step 3
Skim milk powder	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protocol Step 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Cell culture Protocol Step 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protocol Step 3
Water bath	keelrein	NB014467	Heating Protocol Step 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1