Rat Ex Vivo 폐 관류 모델에서 차세대 중합 헤모글로빈 기반 산소 운반체를 사용한 대체 관류 솔루션 탐색

요약

여기에서는 중합된 인간 헤모글로빈(PolyhHb) 기반 산소 운반체를 관류물로 적용하고 이 관류 용액을 쥐 생체 외 폐 관류 모델에서 테스트할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

폐 이식은 적합한 기증자가 없기 때문에 어려움을 겪고 있습니다. 이전에는 미미하거나 부적절하다고 생각되는 기증자는 폐기되었습니다. 그러나 EVLP(ex vivo lung perfusion)와 같은 새롭고 흥미로운 기술은 폐 이식 제공자에게 한계 기증자 동종이식편에 대한 확장된 평가를 제공합니다. 이 동적 평가 플랫폼은 폐 이식의 증가로 이어졌으며 제공자가 이전에 폐기된 기증자를 사용할 수 있도록 하여 기증자 풀을 확장했습니다. 현재의 관류 기술은 세포 또는 무세포 관류물을 사용하며, 둘 다 뚜렷한 장점과 단점이 있습니다. 관류 조성은 항상성 환경을 유지하고, 적절한 신진대사 지원을 제공하고, 염증 및 세포 사멸을 줄이고, 궁극적으로 장기 기능을 개선하는 데 중요합니다. 관류 용액은 적절한 종양 압력을 유지하기 위해 충분한 단백질 농도를 포함해야 합니다. 그러나 현재의 관류 용액은 종종 폐 내피를 통한 유체 유출로 이어져 의도하지 않은 폐 부종과 손상을 초래합니다. 따라서 적절한 세포 항상성을 유지하면서 과도한 손상을 방지하는 새로운 관류 솔루션을 개발할 필요가 있습니다. 여기에서는 중합된 인간 헤모글로빈(PolyhHb) 기반 산소 운반체를 관류물로 적용하고 이 관류 용액을 쥐 EVLP 모델에서 테스트할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 연구의 목표는 폐 이식 커뮤니티에 새로운 관류 솔루션을 설계하고 개발하는 데 필요한 주요 정보와 임상적으로 관련된 중개 이식 모델에서 이를 테스트하기 위한 적절한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서문

고형 장기 이식의 다른 분야와 마찬가지로 폐 이식은 기증 장기의 부족으로 어려움을 겪고 있습니다. 기증자 풀을 늘리기 위해 한때 이식에 적합하지 않다고 여겨졌던 동종이식편, 즉 확장 기준 기증자(ECD)의 잠재력을 조사하는 데 상당한 연구가 전념해 왔습니다. 이러한 동종이식은 의심스러운 품질, 열악한 기능, 감염, 외상, 장기간의 따뜻하거나 차가운 허혈 시간, 고령 ^1,2 등 다양한 이유로 ECD로 간주될 수 있습니다. 이러한 폐가 즉시 이식에 적합한 특정^경우3의 경우, 이식에 대한 적합성을 결정하기 위해 이러한 폐를 추가로 평가하는 것이 제공자와 수혜자 모두에게 유리한 경우가 많다. EVLP(Ex vivo lung perfusion)는 기증자 ^2,4,5,6,7 외부의 폐쇄 회로에서 잠재적인 폐 동종 이식편을 확장할 수 있는 기술로, 이식 제공자가 이식 적합성을 결정할 수 있는 기능을 ....

프로토콜

Sprague-Dawley 쥐(체중 300g)는 상업적으로 입수되어 오하이오 주립 대학 웩스너 메디컬 센터 동물 시설에서 병원체가 없는 조건에서 보관되었습니다. 모든 절차는 NIH 및 National Research Council의 실험 동물의 인도적 관리 및 사용 가이드에 따라 인도적으로 수행되었으며 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 2023A00000071)의 승인을 받았습니다.

1. PolyhHb 합성 및 정제

참고: 다음 EVLP 실험에 사용된 PolyhHb 물질의 생산 및 합성은 2020년 Cuddington et al.에 의해 처음 발표되었습니다²². PolyhHb 합성에 대한 심층적인 회로도 및 분석을 위해 이 작업을 참조하십시오. 다음은 파일럿 스케일에서 PolyhHb의 합성 및 정제와 관류물로서의 후속 준비에 대한 요약입니다.

1. RBC 세척, 용해 및 Hb 정제
   1. 유통기한이 만료된 인간 PRBC 18단위를 조달하여 20L 여과 용기에 붓고 0.9wt% 식염수로 희석하여 최종 헤마토크....

토론

관류 용액의 개발 및 테스트는 전 세계의 많은 사람들이 착수하고 있는 새로운 노력입니다. 전통적으로 표준 관류액은 허혈 시간을 중단시키고 허혈과 관련된 부상을 완화하는 능력과 재관류를 제공한다¹⁸. 그러나 EVLP의 다음 진화는 현재의 관류수 기술을 개선하고 수리 및 재조정 요법을 통합하는 것입니다 39,40,41,42,43.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle	B-D	309301
30 L Glass Batch Bioreactor	Ace Glass
30g Needle	Med Needles	BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets	Elanco	NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°	Fine Science tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater	Lauda	LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Fine Science tools	11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml	APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate	Harvard Apparatus	733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula	Harvard Apparatus	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor	3M	G420	gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)	XVIVO		solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)	Nalgene		Filtration vessels
Peristaltic Pump	Ismatec	ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module	Repligen	N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	For PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonary Artery cannula	Harvard Apparatus	730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	NA
Scissors	Fine Science tools	14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator model 683	Harvard Apparatus	55-000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
TCM time control module type 686	Harvard Apparatus	731750
Tracheal cannula	Harvard Apparatus	733557
Tube set for moist chamber	Harvard Apparatus	73V83157
Tubing Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Tweezer #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved	Kent Scientific Corporation	IND500232
Tweezer #7 Titanium	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM ventilator control module type 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml	Akorn