Naegleria gruberi rDNA의 분자 클론을 N. gruberi Trophozoites로 transfection

요약

이 프로토콜은 시험관 내 영양 영양 환자를 통과시키는 동안뿐만 아니라 encystment 및 excystment를 통해 유지되는 구조로 Naegleria gruberi trophozoites를 transfection하는 방법론을 설명합니다.

초록

Naegleria trophozoites의 모든 리보솜 유전자는 닫힌 원형 염색체 외 리보솜 DNA(rDNA) 함유 요소(CERE)에서 유지됩니다. CERE에 대해 알려진 바는 거의 없지만, 세 가지 Naegleria 종에 대한 완전한 게놈 염기서열 분석은 핵 게놈에 rDNA cistron이 없다는 것을 명확하게 보여줍니다. 또한, 복제의 단일 DNA 기원이 N. gruberi CERE에 매핑되어 CERE가 핵 게놈과 독립적으로 복제한다는 가설을 뒷받침합니다. 이러한 CERE 특성은 공학적 CERE를 사용하여 외래 단백질을 Naegleria trophozoites에 도입하는 것이 가능할 수 있음을 시사합니다. Naegleria에서 CERE를 벡터로 사용하는 방법을 탐색하는 첫 번째 단계로, pGEM7zf+(pGRUB)로 클로닝된 N. 그루베리 CERE의 분자 클론과 N. 그루베리를 transfection하는 프로토콜을 개발했습니다. transfection 후, pGRUB는 N. gruberi trophozoites에서 최소 7개의 구절에 대해 그리고 encystment 및 excystment를 통해 쉽게 검출되었습니다. 대조군으로, trophozoites는 N. gruberi sequences (pGEM) 없이 backbone vector, pGEM7zf+로 transfection되었습니다. pGEM은 N. gruberi로 transfection한 후 첫 번째 통과 후에는 검출되지 않았으며, 이는 진핵생물에서 복제할 수 없음을 나타냅니다. 이러한 연구는 Naegleria trophozoites에 대한 transfection 프로토콜을 설명하고 pGRUB의 박테리아 플라스미드 염기서열이 transfection된 CERE 클론의 성공적인 transfection 및 복제를 억제하지 않음을 보여줍니다. 또한, 이 transfection 프로토콜은 영양체에서 복제를 주도하는 CERE의 최소 염기서열을 이해하고 비리보솜 염기서열(NRS)에서 조절 영역을 식별하는 데 중요합니다.

서문

Naegleria 속에는 45 종이 넘는 종이 포함되어 있지만 종의 모든 구성원이 확인되었을 가능성은 거의 없습니다¹. Naegleria는 trophozoites (amoebae), 편모 또는 자원이 심각하게 제한된 경우 낭종 1,2,3,4로 다양한 형태로 존재할 수 있습니다. Naegleria 속은 거의 보편적으로 치명적인 원발성 아메바성 수막뇌염의 원인인 '뇌 먹는 아메바'(1,2,3,4,5,6,7에서 검토됨)로 알려진 특히 위험한 종인 Naegleria fowleri로 알려져 있습니다.....

프로토콜

이 연구에 사용된 종, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 17,004 염기쌍 pGRUB 구문의 시퀀스는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

1. trophozoites 배양

1. 얼린 N. gruberi trophozoites를 37°C에서 3분 동안 해동합니다.
2. 변형 펩톤/효모 추출물/핵산/엽산/헤민의 T25 플라스크에 10% 태아 송아지 혈청(PYNFH) 배지와 2% 완충액(인산이나트륨, 인산이수소칼륨)을 접종합니다.
3. 25 ° C에서 ~ 80 %가 합류 할 때까지 trophozoites를 배양하면 아메바이드 형태가 나타납니다 (그림 2A).
   참고: 처음 동결 상태에서 영양류 배양을 되살릴 때 T25가 합류하는 데 최대 5-7일이 걸릴 수 있습니다. 3-4일마다 디캔팅 미디어를 교체하고 새 미디어로 교체하십시오.
4. 합류 플라스크를 얼음 위에 5-10분 동안 올려 플라스틱에서 부착된 영양류를 제거합니다. 플라스크를 부드럽게 휘저어 남아 있는 부착 세포를 제거합니다. trophozoit....

토론

본 명세서에 요약된 프로토콜은 매우 간단하지만, 모든 구축물은 구축물의 특성 및 사용된 Naegleria 종에 따라 특히 DNA-transfection 시약 비율의 어느 정도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 당사는 이 프로토콜을 사용하여 상업적으로 이용 가능한 transfection 시약을 하나만 테스트했지만, 다른 여러 시약이 효과적일 수 있습니다. 복제의 기능적 기원을 포함하고 따라서 자율적으로 복제하는 CERE의.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750