Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리)

요약

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

초록

지난 수십 년 동안 호흡기 초복합체(SC)의 존재에 대해 축적된 증거는 미토콘드리아 전자 수송 사슬 조직에 대한 우리의 이해를 변화시켰고, 이는 "가소성 모델"의 제안을 낳았습니다. 이 모델은 조직 또는 세포 대사 상태에 따라 서로 다른 비율의 SC와 복합체가 공존한다고 가정합니다. SC에서 조립의 동적 특성으로 인해 셀은 사용 가능한 연료의 사용과 전자 전달의 효율성을 최적화하여 활성 산소 종 생성을 최소화하고 셀이 환경 변화에 적응할 수 있는 능력을 선호할 수 있습니다.

최근에는 신경퇴행성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병), 바스 증후군(Barth Syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 암(cancer) 등 다양한 질환에서 SC 조립의 이상이 보고되고 있다. 질병 진행에서 SC 어셈블리 변경의 역할은 아직 확인되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 SC 어셈블리 상태를 결정하기에 충분한 양의 샘플을 사용할 수 있는지는 종종 어려운 과제입니다. 이는 크기가 작거나 여러 분석을 위해 나누어야 하는 생검 또는 조직 샘플, 성장이 느리거나 미세유체 장치에서 추출한 세포 배양, 일부 1차 배양 또는 희귀 세포 또는 특정 고가의 처리(나노 입자, 매우 비싼 화합물 등)의 효과를 분석해야 하는 경우에 발생합니다. 이러한 경우 효율적이고 적용하기 쉬운 방법이 필요합니다. 이 논문은 소량의 세포 또는 조직에서 농축된 미토콘드리아 분획을 얻는 데 적합한 방법을 제시하여 기본 전기영동으로 미토콘드리아 SC의 구조와 기능을 분석한 후 겔 내 활성 분석 또는 웨스턴 블롯을 수행합니다.

서문

초복합체(SC)는 개별 호흡 사슬 복합체 ^1,2 사이의 초분자 결합입니다. SC의 초기 식별과 Schägger ^2,3 그룹에 의한 그 구성에 대한 설명 이후, 나중에 다른 그룹에 의해 확인된 이래, SC는 서로 다른 화학량론에서 호흡기 복합체 I, III 및 IV(CI, CIII 및 CIV)를 포함하고 있음이 확인되었습니다. SC의 두 가지 주요 집단을 정의할 수 있는데, CI(및 CIII 단독 또는 CIII 및 CIV)를 포함하고 분자량이 매우 높은(MW, 더 작은 SC의 경우 ~1.5MDa부터 시작: CI + CIII₂) 및 CIII 및 CIV를 포함하지만 CI는 포함하지 않고 훨씬 더 작은 크기(예: ~680kDa의 CIII₂ + CIV). 이러한 SC는 내부 미토콘드리아 막에 유리 복합체와 공존하며 비율도 다릅니다. 따라서, CI는 대부분 관련 형태에서 발견되지만(즉, SCs에서: 소의 심장에서 ~80%, 많은 인간 세포 유형에서 90% ^이상)3, CIV는 자유 형태(소의 심장에서 80% 이상)에....

프로토콜

참고: 모든 배양 배지 및 완충액의 조성은 표 1 에 명시되어 있으며 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 시약과 관련된 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양에서 미토콘드리아 분리

참고: 분석된 세포의 최소 부피는 ~30-50μL의 충전된 세포입니다(1.4단계). 이는 세포 유형(L929 유래 세포에서 5 × 10⁶ 및 10⁷ 세포 사이 또는 MDA-MB-468)에 따라 적어도 2개 또는 3개의 100mm 세포 배양 플레이트 또는 80-90%의 합류점에서 150mm 플레이트 1개에 해당할 수 있습니다. 효율적인 세포 파괴는 중요한 단계입니다.

1. 부착 세포를 약 80% 합류 또는 부유 세포를 적절한 밀도로 성장시킵니다.
2. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다(비부착 세포의 경우 세포 현탁액에서 직접 또는 부착 세포의 경우 1x PBS에서 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 트립신-EDTA 용액을 사용한 표준 트립신화 후).
3. 차가운 1x PBS로 세포를 ....

토론

여기에 설명된 프로토콜에 도입된 방법론적 조정은 미토콘드리아 복합 활성(충분한 양의 샘플의 가용성이 저하될 때 중요함)을 유지하고 조직 또는 세포주의 예상되는 SC 패턴을 재현하면서 손실을 피하고 수율을 높이기 위한 것입니다( 그림 2C 참조).). 이러한 목적으로 SC를 제대로 검출하는 데 높은 미토콘드리아 순도가 필요하지 않기 때문에 가능할 때마다 단계 수, 시간 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001