베이커의 미토콘드리아 변환

요약

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

초록

베이커 효모 맥주효 모균(Saccharomyces cerevisiae )은 수십 년 동안 미토콘드리아 생물학을 이해하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 모델은 진핵생물 사이에서 필수적이고 보존된 미토콘드리아 경로와 곰팡이 또는 효모 특이적 경로에 대한 지식을 제공했습니다. S. cerevisiae 의 많은 능력 중 하나는 미토콘드리아 게놈을 조작하는 능력으로, 지금까지 S. cerevisiae 와 단세포 조류 Chlamydomonas reinhardtii에서만 가능합니다. 효모 미토콘드리아의 생물학적 형질전환(biolistic transformation)을 통해 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation)를 소개하고, 유전자를 재배열하고, 리포터(reporter)를 소개할 수 있습니다. 이러한 접근법은 주로 미토콘드리아에서 고도로 조정된 두 가지 과정, 즉 미토리보솜에 의한 번역과 호흡기 복합체 및 ATP 합성효소의 조립의 메커니즘을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 미토콘드리아 변환은 잠재적으로 다른 경로를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 본 연구에서는 고속 미세발사체 충격에 의해 효모 미토콘드리아를 형질전환시키는 방법, 의도한 형질전환체를 선별 및 정제하는 방법, 원하는 돌연변이를 미토콘드리아 게놈에 도입하는 방법을 보여줍니다.

서문

효모 Saccharomyces cerevisiae는 미토콘드리아 생물 발생을 연구하는 데 사용되는 널리 알려진 모델입니다. 효모는 혐기성, 통성 유기체이기 때문에 호흡을 손상시키는 돌연변이를 도입하는 원인과 결과를 광범위하게 연구할 수 있습니다. 또한 이 유기체는 미토콘드리아 경로를 연구할 수 있는 친근한 유전적 및 생화학적 도구를 보유하고 있습니다. 그러나 호흡 복합체 조립 및 미토콘드리아 단백질 합성의 메커니즘을 탐구하기 위한 가장 강력한 자원 중 하나는 미토콘드리아를 변형시키고 세포 소기관의 게놈을 수정할 수 있는 능력입니다. 이전에는 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 점 돌연변이 또는 작은 결실/삽입(^1,2,3,4,5)을 도입하고, 유전자 ^6,7을 삭제하고, 유전자 재배열(^7,8)을 만들고,

프로토콜

참고: 미토콘드리아 변환 효율은 일반적으로 낮기 때문에 각 구조에 대해 6개의 변환을 수행하는 것이 좋습니다. 상이한 성장 매체의 조성은 표 2에 나타내어져 있다.

1. 텅스텐 입자 제조

1. 마이크로튜브에서 0.7μm 텅스텐 입자(WP, 마이크로캐리어) 30mg을 칭량합니다. 1.5% 에탄올(EtOH) 70mL를 첨가하여 살균합니다. WP를 소용돌이치게 하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
2. 실온에서 13,200 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 입자에 1.5mL의 멸균수를 첨가하고 소용돌이치게 한 다음 실온에서 13,200× g 에서 15분 동안 원심분리하여 WP를 세척합니다. 상층액을 버립니다.
3. 500μL의 멸균 50% 글리세롤을 추가합니다(최종 농도는 WPs/μL 60μg).
   알림: WP는 -20 °C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 스톡에서 6 회 변형에 필요한 양 (100 μL)을 취하십시오.

2. WPs DNA 코팅

1. 미토콘드리아 서열을 포함하는 2 μ p....

토론

본 연구는 효모 S. cerevisiae 에서 미토콘드리아를 성공적으로 변형시키는 방법을 설명했습니다. 고속 미세 발사체 충격에서 의도 된 효모 균주의 정제까지의 과정은 합성 ^rho-train 의 정제 횟수에 따라 8 ~ 12 주가 소요됩니다. 이 방법의 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다. 첫째, 미토콘드리아 유전자 구조에서 돌연변이 부위 주변에 추가되는 측면 영역이 클수록 표적 돌연변이의 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920