Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화

요약

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

초록

효과적인 실시간 이미징 기법은 신경돌기 돌출부를 실시간으로 측정하기 위해 신경 형태를 평가하는 데 매우 중요합니다. 신경돌기 성장의 적절한 측정은 신경 과학 연구 분야에서 수년 동안 오랜 과제였습니다. 이 파라미터는 해리 배양 및 유기형 배양에서 세포주에 이르기까지 수많은 in vitro 실험 설정에서 초석 역할을 합니다. 신경돌기 길이를 정량화함으로써 특정 처리가 효과가 있었는지 또는 다른 실험 그룹에서 축삭 재생이 향상되었는지 확인할 수 있습니다. 이 연구의 목표는 Incucyte Neurotrack 신경돌기 성장 분석 소프트웨어의 견고성과 정확성을 입증하는 것입니다. 이 반자동 소프트웨어는 타임랩스 현미경 시스템에서 사용할 수 있으며, 위상차 이미지에서 신경석 길이를 정량화하는 데 일반적으로 사용되는 방법론에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이 알고리즘은 각 이미지에서 여러 파라미터를 마스킹 및 정량화하고 신경돌기 길이, 분지 점, 세포체 군집, 세포체 군집 면적을 포함한 신경 세포 메트릭을 반환합니다. 첫째, 우리는 소프트웨어의 가치를 피지 플러그인인 수동 NeuronJ의 값과 연관시켜 소프트웨어의 견고성과 정확성을 검증했습니다. 둘째, 위상차 이미지와 면역세포화학 이미지 모두에서 작동할 수 있는 알고리즘을 사용했습니다. 특정 신경 세포 마커를 사용하여 체외 배양에서 감각 뉴런에 대한 형광 기반 신경돌기 성장 분석의 타당성을 검증했습니다. 또한 이 소프트웨어는 개별 세포에서 복잡한 신경 그물에 이르기까지 다양한 파종 조건에서 신경돌기 길이를 측정할 수 있습니다. 결론적으로, 이 소프트웨어는 신경돌기 성장 분석을 위한 혁신적이고 시간 효율적인 플랫폼을 제공하여 더 빠르고 신뢰할 수 있는 정량화를 위한 길을 닦습니다.

서문

좌골 신경에서는 축삭 재생을 측정할 수 있다¹. 또한, 체외 연구는 건강한 뉴런과 손상된 뉴런 모두에서 축삭 발아에서 축삭 변성에 이르기까지 다양한 단계를 이해하기 위해 축삭 돌출 ^2,3을 모니터링하는 것이 타당하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 과정을 추적하면 축삭 극성, 시작, 안정성 및 분기와 같은 매개변수를 측정할 수 있습니다. 마지막 매개변수는 신경병증성 통증 인식 ^4,5,6을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 축삭 변성은 in vivo⁷ 또는 in vitro ^8,9를 모니터링할 수 있다. 신경돌기가 자라는 동안, 액틴(actin) 및 미세소관(microtubule) 세포골격 네트워크는 세포(

프로토콜

1. 기계에서 용기 스캔

참고: 감지는 내장 Basler ace 1920-155 μm 카메라에 의해 수행됩니다.

1. Connect to Device(장치에 연결)를 클릭하고 Schedule - To Acquire(일정 - 획득)를 선택하여 프로그램을 엽니다. 그런 다음 + 기호를 클릭합니다.
2. Scan on Schedule(스케줄에 따라 스캔) 또는 Scan Once Now(지금 한 번 스캔) 옵션을 각각 선택하여 선박을 반복적으로 스캔할지 아니면 1회만 스캔할지 지정합니다.
3. New(새로 만들기)를 선택하여 스캔할 새 용기를 만듭니다. 새 vessel이 추가되지 않은 경우 아래 설명된 옵션 중 하나를 사용하여 새 스캔을 생성합니다.
   1. 현재 스케줄에서 선박을 복사하여 새 선박을 생성하려면 현재 선박 복사 를 선택합니다. Copy Previous(이전 복사 )....

토론

건강, 부상 및 질병 상태에서 뉴런이 어떻게 성장하는지 정확하게 측정하는 것은 신경 과학 분야의 많은 실험 설정에서 중요한 매개 변수입니다. 전체 DRG 외식의 유기형 배양액을 사용하든 해리되지 않은 배양물을 사용하든, 축삭돌기 성장을 적절하게 측정하는 것은 지난 20년 동안 중요한 과제였습니다. 신경돌기 성장에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 정량화가 없다면, NSC-.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660