Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

요약

장내 신경교세포는 장 항상성 및 수술 후 합병증을 포함한 질병 진행에 대한 역할로 점점 더 인식되고 있습니다. 응급 탐색적 개복술에서 회복 중인 말 환자는 수술 후 염증성 질환의 위험이 높기 때문에 연구를 위해 반복 가능한 말 장 신경교세포 배양을 확립하는 것이 중요합니다.

초록

수술 후 염증성 질환인 말 산통(급성 복부)은 고객 비용, 환자의 불편함 및 입원 시간을 증가시킬 뿐만 아니라 많은 경우 생명을 위협하는 것으로 입증되었습니다. 장 세포의 독특한 집단인 장아교세포(enteric glia)는 위장 환경을 감지하고 주변 세포 유형과 소통하는 역할로 점점 더 인정받고 있습니다. 장아교세포와 장 상피 사이의 상호작용은 말 장아교세포가 어떻게 점막 장벽을 변화시켜 건강과 배앓이의 염증을 조절할 수 있는지를 규명하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.

이 상호작용을 연구하기 위해, 우리는 말 jejunum에서 일차 말 장 신경교세포(primary equine enteric glial cultures)를 확립하고 배양균을 배앓이에 존재하는 것으로 알려진 염증성 상태에 노출시키는 방법을 제시합니다. 1차 장 신경교세포(Primary enteric glial cultures)는 배앓이와 관련이 없는 이유로 안락사된 성체 말에서 얻었다. 장 융모와 lamina propria를 미세 절개하여 점막하를 노출시켰습니다. 분리된 점막하층은 콜라겐분해효소, 프로테아제, 소 혈청 알부민으로 2-3시간 동안 효소 소화를 거쳤다. 다음으로, 원심분리, 피펫팅 및 세포 여과기(40-100 μm)를 포함한 기계적 분해를 통해 ~400,000 cells/300 μL의 배지 농도로 0.05 mg/mL 폴리-L-라이신 코팅 웰에 도금하는 데 사용되는 펠릿을 수득했습니다.

합류 및 첫 번째 통과 후, 장 신경교세포는 그런 다음 말 재조합 IL-1β(0, 10, 25ng)에 24시간 동안 노출되었습니다. 배앓이 시 상피-신경교세포 상호작용을 모델링하기 위해, 대조군 또는 처리된 장내 신경교세포에 의해 조절된 배지를 이중 전극 EndOhm 챔버를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정하면서 합류 말 jejunal 단층에 직접 추가되었습니다. 이러한 데이터는 말 장신경교세포(equine enteric glial culture)의 많은 잠재적 영향력 있는 응용 분야 중 하나일 뿐입니다.

서문

말 배앓이는 응급 상담을 위한 가장 흔한 의학적 증상입니다¹. 말의 최대 17%가 외과적 교정이 필요하기 때문에 수술 후 결과를 높이기 위한 노력이 말 의학 연구의 최전선에 있어야 합니다². 현재 수술 후 산통 환자는 패혈증/내독소혈증 쇼크(환자의 12.3%)와 수술 후 장폐색증(환자의 13.7%)을 포함하여 생명을 위협하는 여러 질환의 위험이 ^{높습니다3.} 수술 후 합병증에 대한 치료의 진전에도 불구하고 이러한 상태를 예방하거나 치료하기 위한 고급 치료법의 필요성은 계속되고 있습니다.

최근 연구에서는 배앓이 환자의 국소 및 전신 염증 상태를 강조하고 있다⁴. 예를 들어, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 알파, 인터루킨 1β(IL-1β), 인터루킨 6(interleukin 6, IL-6), 단핵구 화학유인 단백질(monocyte chemoattractant protein-1)과 같은 전염증성 단백질은 모두 정상 장 조직에 비해 배앓이 장 점막에서 발현이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습....

프로토콜

말 장내 신경교세포(Equine enteric glial) 1차 배양균은 이 연구와 관련이 없는 이유로 바르비투르산염을 과다 투여하여 인도적으로 안락사시킨 세 마리의 말에서 얻었다. 배양 연구를 위해 선택된 말은 현재 위장 질환의 병력이 없는 성체 말이었다.

1. 점막하 말 장내 신경교세포 1차 배양

1. 3 개의 별도 성인 말 말에서 얻은 jejunal crypts에서 말 상피 단층을 성장시킵니다.
   1. 24웰 플레이트에 코팅 용액을 37°C에서 2시간 또는 실온에서 하룻밤 동안 코팅하고 멸균수로 2배 세척한 다음 셀이 도금할 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다.
   2. 인도적 안락사 후 60분 이내에 제주눔의 일부를 제거하고 얼음 위의 차가운 링거 용액에 넣으십시오.
   3. 제주눔에서 10cm 부분을 제거하고 항상간장 경계에서 열어 비림프성 영역이 조직 중앙에 오도록 합니다. 해당 부분을 약 7cm x 7cm 부분으로 자릅니다. 해부하기 전에 신선한 Ringer's solution으로 조직을 잘 헹굽니다.
   4. 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시에 조직을 차가운 링거 용액 또는 PBS ....

토론

이 연구의 목적은 말 점막하 장신경교세포의 반복 가능한 1차 배양 방법을 개발하고 배앓이 시 상피-신경교세포 상호작용을 모델링하는 데 적용하는 것을 입증하는 것이었습니다. 말에서 새로운 장 신경교세포 분리 및 배양은 돼지 및 설치류 모델과 인간의 장 질환 경로를 이해하는 데 도움이 되는 것으로 입증되었습니다 ^6,7,13,14

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution