발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

요약

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

초록

제브라피시(Danio rerio)는 다양한 장기와 부속기관을 재생하는 뛰어난 능력을 가지고 있습니다. 제브라피쉬의 뼈 재생은 지느러미 절단, 비늘 뽑기, 두개골 박리 및 현미경 접근법과 같은 다양한 방법을 사용하여 연구되었습니다. 이광자 레이저가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 설정을 사용하여 제브라피시 유충의 발달 중인 배엽에서 뼈 형성 세포(조골세포)를 절제하는 병변 패러다임으로 레이저 절제 방법을 개발했습니다. 여기에 설명된 방법은 면적, 모양 및 깊이를 미세하게 조정할 수 있으므로 정확한 방식으로 세포를 절제할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하면 절제 전후 부위를 이미징할 수 있으므로 부상의 단기적인 영향을 분석할 수 있습니다. 이 실험 설정에서는 손상 부위의 조골세포 절제 후 면역 반응을 연구했습니다. 절제 후 대식세포의 모집 증가가 관찰되었으며, 이는 뼈 재생 중 대식세포의 존재 관련성을 나타냅니다.

서문

제브라피쉬는 망막, 뇌, 심장, 췌장 등 다양한 장기를 재생한다¹. 또한 제브라피쉬는 골격 요소를 재생하기 때문에 지느러미, 비늘 및 calvariae(두개골 ^모자)의 재생을 연구하는 데 사용되었습니다2. 지느러미 절제술(절단), 지느러미 골절, 두개골 절단술 ^3,4, 냉동 손상 ^5,6 또는 유전자 절제술 ^7,8,9와 같은 조직 및 뼈 재생을 연구하기 위해 다양한 실험 패러다임이 사용되었습니다. 최근에는 제브라피시에서 부상 후 치유 및 재생 반응을 연구하기 위해 레이저 절제 접근법이 널리 사용되고 있습니다 10,11,12,13,14.

프로토콜

연구 프로토콜은 Landesdirektion Sachsen의 승인을 받았으며 허가 번호는 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87입니다. 사용된 제브라피시 균주는 국내법에 따라 그리고 앞서 설명한 바와 같이 표준화된 조건 하에서 유지되었다^27,28. 연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재료 및 용액의 준비

1. 배아를 1x E3 배지에서 유지합니다. 170mL의 60x E3 스톡을 탈이온수 10L에 희석하고 2mL의 0.1% 메틸렌 블루를 첨가하여 1x E3 배지를 준비합니다.
   1. 탈이온수 30L에 NaCl 17.2g, KCl 0.76g, CaCl₂·2 H₂O 2.90g, MgSO₄·7 H₂O 4.90g을 혼합하여 1x E3 미디어 스톡을 준비합니다.
2. 유충 ....

토론

레이저 절제술은 생물학 연구의 다양한 분야에 적용되어 왔습니다. 특히, 조직 재생을 연구하는 방법으로 유용하였다^10,11,12. 예를 들어, 선천성 면역 세포의 모집 및 표현형 변화는 최근에 레이저 절제 부위(¹⁰)에서 조골세포의 회수와 함께 UV 레이저 또는 이광자 레이저 절제 분석을 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware