장기 배양 돼지 각막 및 상피 상처 치유를 사용한 치료 및 화학적 독성 평가

요약

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

초록

인간의 눈과 해부학적, 생리학적으로 유사하기 때문에 돼지의 눈은 생물의학 연구 및 안구 독성 평가를 위한 강력한 모델 역할을 합니다. 돼지 눈을 이용한 공기/액체 각막 배양 시스템이 개발되었으며, 이러한 연구의 중요한 매개변수로 생체 외 상피 상처 치유가 활용되었습니다. 신선한 돼지 각막은 상피 상처가 있든 없든 장기 배양을 위해 가공되었습니다. 각막은 MEM에서 37°C의 가습된 5%_CO2 인큐베이터에서 검사제의 유무에 관계없이 배양하였다. 각막 투과성 및 상처 치유율을 측정하고, 면역조직화학, 웨스턴 블로팅, 분자 및 세포 분석을 위한 qPCR을 위해 상피세포 및/또는 전체 각막을 처리할 수 있습니다. 이 연구는 자세한 프로토콜을 설명하고 이 생체 외 시스템을 사용한 두 가지 연구를 제시합니다. 이 데이터는 상피 상처 치유와 결합된 돼지 각막 장기 배양이 화학적 독성 테스트, 당뇨병성 각막병증 연구 및 잠재적 치료법 식별에 적합한 생체 외 모델임을 보여줍니다.

서문

세포 모델은 제한된 클론 개체군을 가지고 있고 유기체의 in vivo 구조를 재현하지 못하지만, 장기 배양 또는 이식은 장기 기능, 발달, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료법에 대한 통찰력을 제공하는 동시에 다른 실험 모델에 비해 윤리적, 생리학적 이점을 제공합니다 ^1,2. 필요한 동물의 수를 줄이는 것 외에도 외식물을 배양하면 주변 조건을 제어하고 현명하게 조작할 수 있으며, 이는 장기 배양 환경에서 세포 증식, 이동, 상처 반응 및 세포 분화를 제어하는 요인을 자세히 탐색하는 데 이상적입니다 ^2,3. 다양한 조직/장기 중^{에서도 인간4,5,6}을 포함한 각막 외엽은 안구 독성, 자극 평가^7,8, 줄기세포 기능⁹ 및 상처 치유

프로토콜

신선한 돼지 각막은 식품 산업의 부산물이기 때문에 기관 동물 보호 및 사용 위원회는 연구를 위한 사용을 승인할 필요가 없었습니다. 연구에 사용되는 인간의 각막과 달리 생물학적 위험의 우려가 없으며, 돼지 눈의 사용하지 않는 부분은 일반 쓰레기로 처분할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 장기배양을 위한 준비

1. 페니실린-스트렙토마이신을 최소 필수 배지(MEM)에 보충제로 첨가하십시오.
2. 당뇨병 환자의 고혈당증을 모방하여 5mM 포도당(90mg/dL에 해당)이 포함된 보충된 MEM 1L에 D-포도당 3.6g을 추가하여 최종 포도당 농도 25mM(450mg/dL과 동일)에 도달하여 고포도당 배양 배지를 준비합니다.
3. 20mL의 MEM에 0.2g 아가로스를 첨가하고 아가로스가 용해될 때까지 전자레인지에서 가열하여 5mM 또는 25mM 포도당과 함께 보충된 MEM에서 1% 아가로스를 준비합니다.
4. 아가로스 함유 용액을 48°C로 유지되는 수조에 넣습니다.
5. 실험 전에 증류수, PBS 및 수술 장비(지혈제,....

토론

배양된 소 각막과 대부분 돼지 각막은 화장품 화학 물질, 녹내장 약물 및 비스테로이드성 항염증제의 독성을 평가하는 데 사용되었습니다^21,26. 돼지 각막은 또한 인간 당뇨병성 각막병증의 생체 외 모델로 사용되었습니다. 토끼 눈과 달리 돼지 눈은 해부학적, 생리학적, 생체역학적으로 인간의 눈을 닮았기 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235