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요약

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

초록

인간의 눈과 해부학적, 생리학적으로 유사하기 때문에 돼지의 눈은 생물의학 연구 및 안구 독성 평가를 위한 강력한 모델 역할을 합니다. 돼지 눈을 이용한 공기/액체 각막 배양 시스템이 개발되었으며, 이러한 연구의 중요한 매개변수로 생체 외 상피 상처 치유가 활용되었습니다. 신선한 돼지 각막은 상피 상처가 있든 없든 장기 배양을 위해 가공되었습니다. 각막은 MEM에서 37°C의 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 검사제의 유무에 관계없이 배양하였다. 각막 투과성 및 상처 치유율을 측정하고, 면역조직화학, 웨스턴 블로팅, 분자 및 세포 분석을 위한 qPCR을 위해 상피세포 및/또는 전체 각막을 처리할 수 있습니다. 이 연구는 자세한 프로토콜을 설명하고 이 생체 외 시스템을 사용한 두 가지 연구를 제시합니다. 이 데이터는 상피 상처 치유와 결합된 돼지 각막 장기 배양이 화학적 독성 테스트, 당뇨병성 각막병증 연구 및 잠재적 치료법 식별에 적합한 생체 외 모델임을 보여줍니다.

서문

세포 모델은 제한된 클론 개체군을 가지고 있고 유기체의 in vivo 구조를 재현하지 못하지만, 장기 배양 또는 이식은 장기 기능, 발달, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료법에 대한 통찰력을 제공하는 동시에 다른 실험 모델에 비해 윤리적, 생리학적 이점을 제공합니다 1,2. 필요한 동물의 수를 줄이는 것 외에도 외식물을 배양하면 주변 조건을 제어하고 현명하게 조작할 수 있으며, 이는 장기 배양 환경에서 세포 증식, 이동, 상처 반응 및 세포 분화를 제어하는 요인을 자세히 탐색하는 데 이상적입니다 2,3. 다양한 조직/장기 중에서도 인간4,5,6을 포함한 각막 외엽은 안구 독성, 자극 평가7,8, 줄기세포 기능9 및 상처 치유10,11의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하기 위해, 원발성 개방각 녹내장12에 광범위하게 사용되어 왔다.

돼지 각막은 인간의 각막과 여러 구조적 및 생리학적 유사성을 공유하여 인간의 각막 생물학 및 질병을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 구조적으로 둘 다 Bowman's layer, 5-7 층의 상피 세포, 유사한 곡률과 직경을 가지고 있습니다. 생리학적으로 매우 투명하고, 유사한 눈물막 조성 및 각막 수분을 가지며, 유사한 각막 신경 분포 패턴과 기능을 나타내고, 유사한 상처 치유 과정을 따르기 때문에 인간의 각막 생물학 및 질병을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다13,14. 인간과 돼지 각막은 콜라겐 피브릴 배열과 수분 함량에 약간의 차이가 있지만 면역 신호 전달과 반응은 동일하지 않습니다. 이러한 차이는 이종장기이식에 문제를 제기한다15. 따라서 실험 데이터를 해석하는 동안 종별 차이를 고려해야 합니다.

인간의 각막과 비교했을 때, 돼지 눈은 육류 산업의 부산물로 쉽게 구할 수 있어 비용 효율적이고 연구에 쉽게 접근할 수 있다14. 돼지 각막을 사용하면 인간 기증자 각막의 필요성을 줄이고 동물 실험과 관련된 윤리적 문제를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 또한 한 번에 많은 돼지 각막을 사용할 수 있기 때문에 일관되고 재현 가능한 실험이 가능하며, 이는 신뢰할 수 있는 연구 결과에 매우 중요합니다.

돼지 각막 장기 배양 시스템은 초기에 화장품 화학 물질 및 안구 약물에 대한 동물 실험을 대체하기 위해 사용되었다7. 이 시스템은 각막 상피 상처 치유를 연구하고 HB-EGF 엑토도메인 탈락, 지질 매개체 리소포스파티드산 자극 및 각막 상처 치유를 위한 EGFR 활성화와 같은 몇 가지 중요한 신호 경로를 식별하는 데 사용되었습니다16,17. 고포도당을 병리학적 요인으로 사용하여 인간 당뇨병성 각막병증을 모방하기 위해 상피 상처 치유를 지연시켜 고혈당증의 생체 외 모델을 확립했습니다. 이 모델을 사용하여 IL-1β 대 IL-1Ra18 및 TGFβ3 대 TGFβ119의 균형 발현이 각막의 적절한 상처 치유에 중요한 요인으로 나타났으며, 이러한 균형의 조작은 당뇨병성 각막병증을 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 돼지 장기 배양은 화학 독성 시험, 생물 의학 연구, 약물 발견, 화학 무기에 대한 안구 노출에 대한 조직 손상 및 복구 평가 등 다양한 응용 분야에서 관련성 있고 경제적이며 조작적인 실험 시스템을 나타냅니다.

이 기사에서는 돼지 각막 장기 배양에 대한 자세한 프로토콜을 설명하고, 각막 건강에 대한 안구 비스테로이드성 항염증제(NS) 점안액의 잠재적 효과를 평가하고 당뇨병성 각막병증의 발병과 관련된 신호 전달 경로 및 생물학적 과정을 결정하기 위한 응용 프로그램을 설명합니다.

프로토콜

신선한 돼지 각막은 식품 산업의 부산물이기 때문에 기관 동물 보호 및 사용 위원회는 연구를 위한 사용을 승인할 필요가 없었습니다. 연구에 사용되는 인간의 각막과 달리 생물학적 위험의 우려가 없으며, 돼지 눈의 사용하지 않는 부분은 일반 쓰레기로 처분할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 장기배양을 위한 준비

  1. 페니실린-스트렙토마이신을 최소 필수 배지(MEM)에 보충제로 첨가하십시오.
  2. 당뇨병 환자의 고혈당증을 모방하여 5mM 포도당(90mg/dL에 해당)이 포함된 보충된 MEM 1L에 D-포도당 3.6g을 추가하여 최종 포도당 농도 25mM(450mg/dL과 동일)에 도달하여 고포도당 배양 배지를 준비합니다.
  3. 20mL의 MEM에 0.2g 아가로스를 첨가하고 아가로스가 용해될 때까지 전자레인지에서 가열하여 5mM 또는 25mM 포도당과 함께 보충된 MEM에서 1% 아가로스를 준비합니다.
  4. 아가로스 함유 용액을 48°C로 유지되는 수조에 넣습니다.
  5. 실험 전에 증류수, PBS 및 수술 장비(지혈제, 겸자, 메스 손잡이, 가위, 트레핀)와 같은 모든 실험 시약과 비커, 종이 타월, 보푸라기가 없는 물티슈, 장갑 및 피펫 팁을 고압멸균합니다. 실리콘 몰드, 면도날 및 면도날 홀더를 70% 알코올에 30분 동안 담그고 멸균 PBS로 세 번 세척합니다.

2. 각막 배양을 위한 돼지 안구 준비

  1. 지역 도살장에서 돼지 안구를 얻어 습한 방에서 얼음 상태로 실험실로 운반합니다.
    참고: 소의 눈도 비슷한 방식으로 사용할 수 있습니다. 그러나 소의 눈과 각막은 사람의 눈/각막과 더 현저하게 다릅니다. 예를 들어, 인간 및 돼지 각막은 5-7 층의 상피 세포를 가지고 있는 반면, 소의 각막은 약 20 층을 가지고있다 13,14. 더욱이, 소의 눈은 각막 장기 배양 중에 오염될 가능성이 더 높습니다. 따라서 통계 분석을 위해 더 많은 소의 눈이 필요합니다.
  2. 멸균된 PBS가 들어 있는 1L 비커에 돼지 눈을 넣습니다.
    참고: 돼지 안구는 도축 후 1시간 이내에 수집되어 약 2시간 내에 실험실로 운송됩니다. 전반적으로, 눈은 4시간 이내에 사용되었다(단계 2.3).
  3. 핀셋으로 안구를 잡고 멸균 페트리 플레이트에서 가위로 안구 외 조직을 제거합니다.
  4. 증류수로 한 번, PBS로 안구를 두 번 헹굽니다.
  5. 포비돈-요오드 소독액으로 눈 전구를 10초 동안 헹구고 멸균된 PBS를 세 번 씻습니다.
  6. 20μg/mL 겐타마이신이 함유된 PBS에서 안구를 30분 동안 배양하고 PBS로 두 번 헹굽니다.

3. 상피 상처

  1. 멸균된 보푸라기가 없는 물티슈로 안구를 잡고 각막 중앙을 6mm 트레핀으로 표시합니다.
  2. 작은 메스 또는 모서리가 무딘 부드러운 면도날로 트레핀이 표시된 원 안의 상피 세포를 부드럽게 긁어내고 모든 세포 파편을 제거하되 기저막은 그대로 두고 면봉으로 상처 부위를 청소합니다.
    알림: 수집된 상피 세포가 있는 메스는 얼음 위에 놓인 미세 원심분리기 튜브로 옮길 수 있습니다. 세포는 즉시 용해하거나 -20 °C 냉동고에 보관하여 대조군 역할을 할 수 있습니다.

4. 각막 장기 배양 및 생체 외 고혈당증 모델링

  1. 메스와 가위로 각막-공막 테두리를 따라 절개하여 안구를 절개하고 PBS(pH 7.4)가 포함된 멸균된 1000mL 비커로 각막을 헹굽니다.
  2. 절제된 각막을 무독성 액체 곰팡이 만들기 실리콘으로 만든 멸균 곰팡이에 거꾸로 넣습니다.
    참고: 30mL 초원심분리기 튜브의 바닥을 사용하여 반원형 금형을 만들기 위해 50mL 조직 배양/시험관 랙의 구멍에 무독성 실리콘 금형 제작 액체를 붓습니다.
  3. 48°C에서 유지되는 1% 아가로스를 함유한 MEM으로 내피 각막강을 채우고 혼합물이 실온에서 겔화되도록 합니다.
  4. 각막을 뒤집어 35mm 접시에 옮기고, 검사제의 유무에 관계없이 2mL의 MEM을 중앙 각막 표면에 적하하여 윤부 결막 영역을 덮고 상피가 공기에 노출되도록 합니다(그림 1).
  5. 배양 접시를 37°C의 가습된 5%CO2 인큐베이터에 넣고 2일 동안 매일 검사제 유무에 관계없이 배지를 새로운 MEM 배지로 교체합니다.
  6. MEM에 L-glucose를 첨가하여 총 25mM glucose에 도달하여 1% 아가로스 겔 제조 및 배양 배지로 사용되는 ex vivo 고혈당 모델을 구축합니다.

5. 각막 기능 평가

  1. Richardson's staining20으로 상처 각막을 염색하여 남은 상처 부위를 표시하고 사진을 찍어 상피 상처 치유율을 결정합니다(그림 2 및 그림 3). Image-J 또는 Photoshop 소프트웨어(히스토그램)로 상처 크기를 정량화합니다.
  2. 조직학, 조직화학 및 면역조직화학 분석을 위한 각막(그림 2 및 그림 3)을 OCT 및 저온 유지 절편에 삽입하여 처리합니다. 얼음처럼 차가운 아세톤으로 절편을 고정하거나, H&E 염색으로 염색하거나, 단백질 및 신호 분자(예: 인산화된 Erk 및 ATK)를 검출하기 위해 TUNEL 염색 또는 면역조직화학을 위해 1시간 동안 1% BSA로 차단합니다.
    참고: 시판되는 대부분의 항체는 돼지 항원에 대해 테스트되지 않았습니다. 그러나 항체가 인간과 생쥐 항원을 모두 인식하는 경우 주로 해당 돼지 항원 Western blotting 및 면역조직화학을 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 염색된 각막을 PBS로 세척하고 동일한 크기의 트레핀을 사용하여 원래의 상처를 표시하고 마커 서클 내의 상피 세포를 스크랩합니다.
    1. 작은 메스로 상피 세포를 수집하고, 수집 된 세포로 메스를 얼음에 미리 냉각 된 원심 분리기 튜브에 담그십시오.
    2. 수집된 세포를 -80°C 급속 냉동고에 보관하거나 즉시 추출하고 웨스턴 블로팅 및/또는 ELISA를 위한 용해 또는 PCR(필요한 경우)을 위한 RNA 추출 버퍼에서 용해를 수행합니다(필요한 경우)10,16,21.

결과

백내장 수술은 전 세계적으로 가장 빈번하게 시행되는 수술 중 하나이며, 점안액은 수술 후 관리에서 중요한 역할을 합니다. 백내장 수술 후 점안액을 사용하면 눈 감염, 염증, 황반 부종과 같은 합병증을 예방하는 데 도움이 됩니다. 케토롤락, 브롬페낙, 네파페낙을 포함한 비스테로이드성 항염증제(NS) 점안액은 백내장 수술 전, 수술 중, 수술 후 눈의 통증과 부종을 치료...

토론

배양된 소 각막과 대부분 돼지 각막은 화장품 화학 물질, 녹내장 약물 및 비스테로이드성 항염증제의 독성을 평가하는 데 사용되었습니다21,26. 돼지 각막은 또한 인간 당뇨병성 각막병증의 생체 외 모델로 사용되었습니다. 토끼 눈과 달리 돼지 눈은 해부학적, 생리학적, 생체역학적으로 인간의 눈을 닮았기 ...

공개

없음.

감사의 말

소와 돼지 각막 장기 배양 발전에 기여한 Keping Xu 박사(M.D. 및 O.D.)와 Jia Yin 박사(M.D. 및 Ph.D.)와 Troy High School의 Ray Guo와 Andy Wu에게 그림 1의 삽화에 감사드립니다. Yu 박사의 실험실 연구는 NIH 보조금(R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068)과 Kresge Eye Institute의 실명 예방 연구(Research to Prevent Blindness)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL tubesAxygenAXYMCT175SP
Agarose Thermo ScientificR0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09% 
CameraCanonPowerShot A620
Cell Culture DishCorning430165
D-glucose Sigma50-99-7
Dissecting microscope ZeissStemi 2000c
ForcepsFisherScientific10-316A
HemostatFisherScientific13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%Kresge Clinic
KimwipesKimtech34155
LL-37Tocris5213/1
Minimum essential medium (MEM) GibcoA1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1% 
Penicillin-streptomycin Gibco15070063
Phosphate buffered salineSigmaP4417
Pig eyes Bernthal Packing Inc.
Pipet tipsVWR76322-164
Porcine corneasBernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI 
Povidone-Iodine Betadine
Q-Tips cotton swabsQ-Tips
Razor bladeElectron Microscopy Sciences72002-01
Razor blade holder Stotz
ScalpelBard-Parker377112
Scalpel HandleBard-Parker#3
ScissorsFisherScientific08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosureLabconco5100000
TrephineAcu.Punch3813775
Water bath VWR1235

참고문헌

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