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세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가
요약
여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.
초록
(매크로)자가포식은 근본적인 세포 분해 경로를 나타냅니다. 이 과정에서 자가포식소체(autophagosome)로 알려진 이중막 소포(double-membraned vesicles)가 세포질 내용물을 집어삼키고, 이후 리소좀(lysosome)과 융합하여 분해됩니다. 자가포식 관련 유전자는 일반적인 역할 외에도 염증 분자, 조직 복구 인자, 세포외 소포체(EV)의 방출과 관련된 분비 경로를 조절합니다. 특히, 특히 뇌와 척수에 영향을 미치는 신경퇴행성 질환에서 세포 간에 병리학적 단백질을 전파하는 과정은 이 현상을 이해하는 것의 중요성을 강조합니다. 최근 연구에 따르면 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 변성의 핵심 원인인 전이 반응 DNA 결합 단백질 43kDa(TDP-43)는 특히 자가포식체-리소좀 융합이 억제될 때 자가포식 마커 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B-II(LC3-II)가 풍부한 EV를 통해 자가포식 의존적 방식으로 방출됩니다.
LC3-II 양성 EV의 형성 및 방출의 기전을 규명하기 위해서는 세포 내 및 세포 외 LC3-II 양성 소포를 평가하기 위한 접근 가능하고 재현 가능한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 이 연구는 차등 원심분리를 통해 얻은 세포 및 EV 분획에서 면역블로팅을 통해 LC3-II 수준을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 자가포식소체-리소좀 융합 억제제인 바필로마이신 A1(Baf)은 세포내 및 세포외 LC3-II 양성 소포의 수준을 향상시키는 양성 대조군 역할을 합니다. 종양 감수성 유전자 101(TSG101)은 다낭체의 마커로 사용됩니다. 이 프로토콜을 적용하면 산발성 크로이츠펠트-야콥병의 유전적 위험 인자인 syntaxin-6(STX6)의 siRNA 매개 knockdown이 Baf로 처리된 세포의 EV 분획에서 LC3-II 수준을 증가시키지만 TSG101 수준에는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었습니다. 이러한 발견은 STX6가 특히 자가포식체-리소좀 융합이 손상된 조건에서 EV를 통한 LC3-II의 세포외 방출을 부정적으로 조절할 수 있음을 시사합니다. 자가포식을 평가하기 위한 확립된 방법과 결합된 이 프로토콜은 LC3-II 양성 EV의 형성 및 방출에서 특정 분자의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
서문
트랜스활성화 반응 DNA 결합 단백질 43(TDP-43)은 세포 생존에 필수적인 엑손 스플라이싱, 유전자 전사 및 mRNA 안정성 조절에 관여하는 널리 발현되는 이질적인 핵 리보핵단백질입니다 1,2. 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두엽 변성(FTLD)과 같은 신경 퇴행성 질환에서는 핵 단백질 TDP-43이 세포질에 비정상적으로 축적됩니다. 이러한 변화는 핵에서 TDP-43 기능의 상실과 세포질에서 독성 기능 이득을 초래합니다. TDP-43의 병리학적 축적은 뇌와 척수의 특정 영역에서 시작되어 프리온과 같은 방식으로 이 영역을 통해 퍼져나가는데, 이는 질병 진행과 밀접한 관련이 있는 과정이다3. 그러나 TDP-43 병리가 뇌와 척수를 통해 퍼지는 정확한 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다.
TDP-43은 세포외 소포체(EV)를 통해 분비되며, ALS 및 FTLD-TDP 환자의 혈장 및 뇌척수액(CSF)에서 TDP-43 수치가 상승하는 것이 감지됩니다
프로토콜
1. HeLa 세포의 배양 배지에서 세포, P1 및 P2 EV 분획의 준비
- HeLa 세포의 배양 배지로부터 P1 및 P2 EV 분획의 제조
- 1일차
- 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 DMEM High Glucose, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 배양 배지가 포함된 6cm 플레이트에 1 × 106 개의 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
- 2일차(선택 사항)
- 20μM siRNA 용액을 준비합니다.
- 저머무름 튜브에 100μL의 환원 혈청 배지와 3μL의 siRNA를 혼합하여 용액 A를 준비합니다.
- 100 μL의 환원 혈청 배지와 5 μL의 transfection 시약을 저머무름 튜브에 혼합하여 용액 B를 준비합니다.
- 용액 A와 용액 B를 혼합한 다음 혼합물을 실....
- 1일차
결과
이전 연구에서 나타난 바와 같이, Baf 처리는 EV가 풍부한 분획에서 TSG101(P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, EZR19에서 양방향 ANOVA로 결정) 및 LC3-II(P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)의 수치를 증가시켰다. 특히, Baf 처리는 EV 분획에서 STX6(P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)를 증가
토론
면역블로팅 연구에서는 세포 분획, 미세소포가 풍부한 P1 EV 분획, 엑소좀이 풍부한 P2 EV 분획에서 LC3-II 및 TSG101 수치가 밝혀졌습니다. 자가포식체(autophagosome), 자가리소좀(autolysosome) 및 오메가솜(omegasome)을 검사하기 위해 생세포 이미징을 사용하여 STX6 knockdown이 자가포식에 영향을 미치는지 여부에 대한 통찰력을 제공했습니다. 이러한 결합된 결과는 STX6 knockd.......
공개
저자는 이 기사의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 말
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI [보조금 번호 23K06837](일본 도쿄)와 다케다 과학 재단(일본 오사카)의 Y.T.에 대한 자금 지원으로 이루어졌습니다. 저자들은 HeLa 세포를 공급한 David C. Rubinsztein 박사(영국 케임브리지 케임브리지 의학 연구소)에게 감사를 표합니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 % Trypsin EDTA | Fujifilm Wako | 201-16945 | |
| 10 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 150464 | |
| 15 mL Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 200 μL Pipette Tip | Nippon Genetics | FG-301 | pipetting |
| 2-Mercaptoethanol | Nacalai Tesque | 21417-52 | a material for sample buffer solution |
| 3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Nacalai Tesque | 11009-41 | a material for DAB solution |
| 3.5 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| 6 cm Dish | TrueLine | TR4001 | |
| Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths) | EYELA | 273860 | |
| Aspirator | SANSYO | SAP-102 | inhaling solution |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Bafilomycin A1 | Adipogen | BVT-0252 | |
| Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | 2nd antibody for immunoblotting |
| Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-2000 | 2nd antibody for immunoblotting |
| Blocking One | Nacalai Tesque | 03953-95 | a material for immunoblotting |
| Bromophenol Blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | a material for sample buffer solution |
| Calf Serum | cytiva | SH30073.03 | |
| CanoScan LiDE 220 | Canon | CSLIDE220 | Scanner |
| Centrifuge 5702 R | eppendolf | 5703000039 | |
| Counting Slides Dual Chamber | Bio-Rad | 1450015J | cell counting |
| Digital Sonifier 450 | BRANSON | ||
| Dimethyl Sulfoxide | nacalai tasque | 09659-14 | vehicle |
| DMEM High Glucose | Nacalai Tesque | 08458-45 | culture medium |
| DMEM without Phenol Red | Nacalai Tesque | 08489-45 | culture medium |
| EGTA | Dojindo | 348-01311 | a material for A68 solution |
| Excel | Microsoft | version 16.16.27 | satistical analysis |
| EZR | Reference No. 24 | version 1.68 | satistical analysis |
| FBS | Sigma | 173012 | Culture medium |
| Fiji | NIH | Image analysis tool | |
| Glycerol | Nacalai Tesque | 09886-05 | a material for sample buffer solution |
| Hoehst33342 | Dojindo | H342 | |
| Hydrogen Peroxide | Fujifilm Wako | 080-0186 | a material for DAB solution |
| Kimwipe S-200 | NIPPON PAPER CRECIA | 62011 | cleaning wipe |
| Low Retention Tube | Nippon Genetics | FG-MCT015CLB | siRNA and DNA transfection |
| LSM780 Confocal Laser Microscope | Carl Zeiss | ||
| Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody | MBL | M186-3 | 1st antibody for immunoblotting |
| Nickel(II) Chloride Hexahydrate | Fujifilm Wako | 149-01041 | a material for DAB solution |
| N-Lauroylsarcosine Sodium Salt | Nacalai Tesque | 20117-12 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | siRNA and DNA transfection |
| pEGFP-C1-hAtg13 | Addgene | 22875 | |
| Penicillin/Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Culture medium |
| Pierce BCA Protein Assay Kits | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody | BioAcademia | 70-080 | 1st antibody for immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody | ProteinTech | 10841-1-AP | 1st antibody for immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody | ProteinTech | 28283-1-AP | 1st antibody for immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody | ProteinTech | 20986-1-AP | 1st antibody for immunoblotting |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Milliore | IPVH00010 | a material for immunoblotting |
| R | R development core team | version 4.4.1 | satistical analysis |
| RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778 | siRNA transfection reagent |
| siRNA STX6 | Thermo Fisher Scientific | HSS115604 | siRNA for transfection |
| Sodium Chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | a material for Tris buffer and A68 solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fujifilm Wako | 192-13981 | a material for sample buffer solution |
| SPARK Microplate Reader | TECAN | ||
| Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC | Thermo Fisher Scientific | 12935300 | siRNA transfection |
| Sucrose | Fujifilm Wako | 193-00025 | a material for A68 solution |
| TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer | Bio-Rad | 1450109J1 | cell counting |
| Thermobath | TOKYO RIKAKIKAI | MG-3100 | incubation |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | DNA transfection reagent |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR2300 | DNA transfection reagent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Nacalai Tesque | 35406-75 | a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution |
| Trypan Blue Dye 0.40% | Bio-Rad | 1450021 | cell counting |
| Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm | Beckman Coulter | 361706 | collecting for the P1 EV fraction |
| Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Coulter | 344059 | collecting for the P2 EV fraction |
| Vectastain ABC Standard Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | immunoblotting |
| Wash Bottle | As One | 1-4640-02 | washing membrane |
| μ-Slide 8 Well High | ibidi | 80806 |
참고문헌
- Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
- Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Impli....
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